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據(jù)統(tǒng)計，預(yù)計到2030年，胰腺癌將成為美國癌癥相關(guān)死亡的第二大疾病。而死亡的主要原因之一是腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，在藥物發(fā)展中急需能夠阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的新方法以及新藥物。

關(guān)鍵膜受體的分布和降解在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。肌纖維素（MYOF）是一種內(nèi)吞和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜蛋白，在胰腺癌、乳腺癌、細(xì)胞淋巴瘤和肺癌中有明顯的高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)。有文獻(xiàn)表明，MYOF通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白如表皮生長因子受體（EGFR），血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR 2）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性參與癌細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，MYOF是維持胰管腺癌線粒體分支結(jié)構(gòu)和高氧化磷酸化活性所必需的，影響胰腺癌細(xì)胞的能量代謝。因此，應(yīng)用新型MYOF調(diào)節(jié)劑治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌是一種很具吸引力的治療方法。

華東師范大學(xué)陳益華、易正芳、劉明耀課題組報導(dǎo)了一系列的1,5-二芳基-1,2,4-三唑衍生物，活性測試表明，先導(dǎo)化合物6y在體內(nèi)外均顯示出有效的抗胰腺癌活性。相關(guān)研究表明，6y可能與新型抗腫瘤轉(zhuǎn)移靶點肌鐵蛋白（MYOF）結(jié)合，調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。機(jī)制研究表明，6y通過逆轉(zhuǎn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)移，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶分泌，阻斷受體酪氨酸激酶，抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移。

在該課題組以往的研究基礎(chǔ)上，作者將2,3-二芳基-4-噻唑啉酮類化合物2a作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。作者將母核結(jié)構(gòu)換為三氮唑，增加抗轉(zhuǎn)移活性；將二芳基換為親水性雜環(huán)芳香類結(jié)構(gòu)以改善其理化性質(zhì)，對鹵代苯乙基側(cè)鏈也進(jìn)行了優(yōu)化（Figure 2）。

（來源：J. Med. Chem.）

通過對所有設(shè)計的化合物進(jìn)行抗轉(zhuǎn)移活性測試，作者發(fā)現(xiàn)化合物6y（IC₅₀ = 0.11 μM）表現(xiàn)出與陽性對照1d（IC₅₀ = 0.16 μM）相當(dāng)?shù)目惯w移活性。

（來源：J. Med. Chem.）

為了進(jìn)一步驗證6y的抗遷移活性，作者選擇了另外兩個胰腺癌細(xì)胞系MiaPaCa 2和Capan 2進(jìn)行細(xì)胞遷移實驗（Figure 3）。結(jié)果表明，6y濃度依賴性地減少了MiaPaCa 2和Capan 2細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)，表明其對胰腺癌細(xì)胞的運(yùn)動有較強(qiáng)的抑制作用。

（來源：J. Med. Chem.）

由于化合物6y具有潛在的抗轉(zhuǎn)移、抗入侵活性及良好的理化性質(zhì)，因此，作者在細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上對其毒性進(jìn)行考察。作者利用MTS法對人胰腺癌細(xì)胞系（MiaPaCa 2和PANC1細(xì)胞）和正常人細(xì)胞系（HPED6-C7, HAF和MCF-10A）測定半數(shù)最大抑制濃度（IC₅₀）（Table 5）。結(jié)果表明，化合物6y對3株胰腺癌細(xì)胞的IC₅₀值為2.85?0.84 μm，在3株正常人細(xì)胞系的IC₅₀值為8.54?27.56 μm。為了排除6y的細(xì)胞毒性導(dǎo)致抑制細(xì)胞遷移的可能性，作者用不同濃度（0.1，0.3，1.0μm）的6y對PANC1進(jìn)行了額外的實驗（Figure S1）。結(jié)果表明，化合物6y對PANC1的細(xì)胞毒性不影響其抗腫瘤作用。

（來源：J. Med. Chem.）

作者為了探討本系列化合物的可能靶點, 采用SPR生物傳感器對肌C2D結(jié)構(gòu)域與3種代表性化合物（6p，6k，6y）的相互作用進(jìn)行了研究。6k是最先被測定出在PANC1細(xì)胞抗轉(zhuǎn)移活性測試中IC₅₀值低于1 μm的化合物，6p由于C環(huán)中乙基的取代使生物活性增加了大約4倍（6p vs 6k），因此可用于觀察相應(yīng)的結(jié)合親和力變化。6y具有最佳的抗菌、抗入侵活性和最優(yōu)良的理化性能。結(jié)果顯示 ，化合物6y與肌球蛋白C2D蛋白呈濃度依賴性和可逆性結(jié)合，Kd值為0.094 μm（Figure 4）。

（來源：J. Med. Chem.）

STD是研究配體?受體相互作用的最有力的核磁共振技術(shù)之一。作者利用STD-NMR技術(shù)，觀察了化合物6y與MYOF的直接結(jié)合（Figure 5）。與SPR實驗結(jié)果一致，在STD譜中觀察到6y與MYOF的直接結(jié)合。嘧啶和甲氧基的SDD信號較弱，表明嘧啶（環(huán)A）和甲氧基基團(tuán)比環(huán)B更易溶于溶劑。相反，位于N取代側(cè)鏈尾部的苯環(huán)上的質(zhì)子1和環(huán)C上乙基取代處的質(zhì)子表現(xiàn)出最強(qiáng)的STD信號，表明這些質(zhì)子被掩埋在蛋白質(zhì)中。

（來源：J. Med. Chem.）

化合物6y通過SPR和STD-MR實驗證明與MYOF結(jié)合，且具有良好的生物活性和理化性質(zhì)。為了確定6y的生物學(xué)效應(yīng)是否與MYOF有關(guān)，作者對MYOF基因敲除細(xì)胞和MYOF過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行了6y敏感性試驗（Figure 6）。結(jié)果表明，MYOF基因敲除的PANC 1細(xì)胞減少了遷移，顯示出MYOF在遷移中的關(guān)鍵作用。PANC 1細(xì)胞株對MYOF的基因消融導(dǎo)致細(xì)胞對6y的敏感性降低?；蛘缺磉_(dá)MYOF恢復(fù)化合物6y的抗移植物活性,表明6y通過與MYOF作用，抑制了癌細(xì)胞遷移。

（來源：J. Med. Chem.）

因為6y能夠明顯的抑制胰腺癌的轉(zhuǎn)移和增殖，并且對MYOF有結(jié)合作用，作者在基于熒光素酶的動物生物發(fā)光成像技術(shù)基礎(chǔ)上，以BALB/c裸鼠胰腺癌肺轉(zhuǎn)移模型測試了6y的抗轉(zhuǎn)移活性（Figure 7）。結(jié)果顯示，6y呈劑量依賴性抑制胰腺癌肺轉(zhuǎn)移，且抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性優(yōu)于同劑量陽性對照組。在第20天，處理組的平均發(fā)光下降約3倍和5倍（分別為25和50 mg/（kg·d））。表明肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)明顯減輕。3周后存活率分別為25%（陰性對照）、60%（陽性對照）、75%（6y，25 mg/(kg·d)）和87.5%（6y，50 mg/(kg·d）。證明化合物6y顯著延長了整體存活時間。

 （來源：J. Med. Chem.）

最后，作者對化合物6y抗腫瘤轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制進(jìn)行了研究。EMT是細(xì)胞極性喪失、間充質(zhì)和遷移表型產(chǎn)生的過程，促使腫瘤細(xì)胞向侵襲性表型轉(zhuǎn)移。因有報道稱MYOF基因消融可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的EMT，作者探討了PANC 1細(xì)胞的EMT過程是否受6y的影響。Western blot結(jié)果顯示，6y可以逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞進(jìn)入上皮狀態(tài)。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞會分泌多種MMPs降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜來促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。作者對經(jīng)6y處理的PANC 1細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行收集濃縮，發(fā)現(xiàn)6y梯度依賴性抑制PANC 1細(xì)胞中MMP1和MMP2的分泌。

MYOF是RTK循環(huán)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而VEGFR和EGFR是胰腺癌臨床治療的兩個主要的RTK藥物靶點。因此作者檢測了6y對VEGFR和EGFR的影響。Western blot分析顯示，6y可降低PANC 1細(xì)胞中VEGFR 2和EGFR 2的水平。6y處理PANC1細(xì)胞可引起EGFR在10 ng/ml EGF刺激下的持續(xù)磷酸化，阻斷EGFR信號通路。這些結(jié)果表明，6y通過VEGFR 2和EGFR 2通路以劑量依賴的方式抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

（來源：J. Med. Chem.）

總結(jié)：華東師范大學(xué)陳益華、易正芳、劉明耀課題組報導(dǎo)了一種新的預(yù)防胰腺癌轉(zhuǎn)移的治療策略。通過對一系列二芳基1,2,4-三唑衍生物進(jìn)行篩選，作者發(fā)現(xiàn)化合物6y以納摩爾的IC₅₀值抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移和增殖，SPR分析表明，6y與MYOF-C2D具有納摩爾級的親和力。STD-NMR實驗表明，芳香尾鏈?zhǔn)窃撘种苿┳铍[蔽的區(qū)域，而A環(huán)則是該化合物中溶劑暴露程度最高的部分?；衔?/span>6y對MYOF基因敲除細(xì)胞沒有明顯的抑制作用，并恢復(fù)了對MYOF基因敲除細(xì)胞的活性。更重要的是，化合物6y能有效地阻斷PANC 1在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，而沒有表現(xiàn)出明顯的毒性。MYOF抑制劑可能通過逆轉(zhuǎn)EMT，抑制MMP1和MMP2的分泌，同時影響VEGFR 2和EGFR的磷酸化而發(fā)揮其作用。

撰稿人：安fen