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中國科學(xué)院大學(xué)齊莉課題組Anal. Chem.： 腦系統(tǒng)中D-葡萄糖的選擇性捕獲和原位可控檢測
來源：化學(xué)加（ID：tryingchem） 2020-04-07
導(dǎo)讀：為了在高性能的復(fù)雜水介質(zhì)中監(jiān)測D-葡萄糖（Glu），中國科學(xué)院大學(xué)齊莉課題組探索了一種新的“選擇性捕獲和可控檢測”納米反應(yīng)器。在自組裝的膠束化納米反應(yīng)器的表面，立體精確放置的苯硼酸(PBA)在嵌段共聚物結(jié)構(gòu)中提供了識別單元，合成了聚馬來酸酐苯乙烯-N-異丙基丙烯酰胺-(4-氨基苯基)硼酸[P(MAn-St-NIPAm-PBA)]。其作為納米反應(yīng)器的熱敏部分，嵌入葡萄糖氧化酶和肌紅蛋白基催化劑，通過溫度變化實現(xiàn)Glu的可控酶解。當納米反應(yīng)器與Glu混合后，在酶解過程中產(chǎn)生的醌的紫外-可見光強度發(fā)生了明顯的變化。同時用納米反應(yīng)器方法成功地監(jiān)測了大鼠腦缺血微透析液中的Glu，證明了構(gòu)建用于腦系統(tǒng)應(yīng)用的納米反應(yīng)器的可行性。研究成果在Anal. Chem. 上發(fā)表。（DOI：10.1021/acs.analchem.9b05393）
D-葡萄糖(Glu)是體液中必需的能量來源。生理和病理事件中Glu濃度的變化提示可能的生物學(xué)功能障礙。制造可靠的Glu傳感器，特別是涉及大腦功能和神經(jīng)傳遞的傳感器，一直是來自不同學(xué)科的研究人員的長期目標。目前Glu選擇性探針可分為兩類:一類是基于利用葡萄糖氧化酶(GOx)水解產(chǎn)物監(jiān)測Glu的策略。另一種方法是將醇與PBA在水介質(zhì)中可逆結(jié)合來檢測Glu。近年來，依據(jù)分子結(jié)構(gòu)設(shè)計或GOx的串聯(lián)催化反應(yīng)設(shè)計的與Glu特異反應(yīng)的探針都依賴于在復(fù)雜樣品中添加探針和傳感Glu，這就增加了立體異構(gòu)體干擾的可能性。為了克服這個問題，科學(xué)家做出了很多努力，比如用Glu作為連接劑來引起染料的聚集，或者設(shè)計對Glu更具選擇性的分子結(jié)構(gòu)，但是由于Glu選擇性傳感探針的合成復(fù)雜且困難以及Glu即使被識別也難以分離等原因，Glu的選擇性和可控性檢測并不容易實現(xiàn)。受“釣魚”概念——從一個復(fù)雜的矩陣中捕獲特定的配體的啟發(fā)，中國科學(xué)院大學(xué)齊莉課題組在Glu傳感探針的構(gòu)建中提出 “選擇性捕獲和可控檢測”的策略，設(shè)計了一種直接靶向的熱納米反應(yīng)器，該反應(yīng)器包含聚合物鏈硼酸單元作為捕獲配體和用于調(diào)節(jié)傳感效率的熱響應(yīng)閥。匹配的良好親和力和高選擇性需要將識別元素硼酸單元立體精確地放置在適當?shù)奈恢?，并且它們的方向?qū)τ趦?yōu)化捕獲Glu非常重要。受1,2-二醇與PBA可逆共價結(jié)合的啟發(fā)，作者提出了一種新機制，該機制基于良好的嵌段共聚物聚馬來酸酐苯乙烯-N-異丙基丙烯酰胺-(4-氨基苯基)硼酸[P(MAn-St-NIPAm-PBA)]對于Glu的特定靶向性。該共聚物通過使用可逆加成-裂解鏈轉(zhuǎn)移法的活性/控制聚合方法實現(xiàn)。首次聚合最初是通過使用引發(fā)劑和鏈轉(zhuǎn)移劑進行的。然后通過沉淀和過濾獲得產(chǎn)物PS-MAn，再利用其作為大分子鏈轉(zhuǎn)移劑，逐步實現(xiàn)P(MAn-St-NIPAm)和P(MAn-St-NIPAm-PBA)的合成。一系列的PBA單元在嵌段共聚物上修飾，自組裝后PBA單元在膠束表面緊密分布，相鄰的PBA單元可以在“正確”的方向與不同的羥基反應(yīng)，以確保PBA-Glu-PBA復(fù)合物的形成。而其他非Glu糖由于不同的立體結(jié)構(gòu)，不與P(MAn-St-NIPAm-PBA)發(fā)生反應(yīng)。與水介質(zhì)中的游離PBA相比，P(MAn-St-NIPAm-PBA)可以選擇性捕獲Glu。且捕獲并從復(fù)雜樣品中分離出Glu后，Glu的pH釋放和納米反應(yīng)器中熱響應(yīng)控制的梯度酶反應(yīng)可對Glu進行可控檢測。由于 “選擇性捕獲”步驟消除了Glu天然立體異構(gòu)體的可能干擾，因此用于Glu檢測的串聯(lián)催化反應(yīng)具有良好的靈敏度和選擇性。此外，熱響應(yīng)控制的酶反應(yīng)將為Glu的可控檢測提供新的途徑。圖1.納米反應(yīng)器的設(shè)計。(A) P(MAn-St-NIPAm-PBA)中PBA立體精確放置從而實現(xiàn)Glu選擇性捕獲。(B)鼠腦微透析過程示意圖。(C)中空納米反應(yīng)器對Glu的捕獲和釋放過程。(D)以GOx酶和肌紅蛋白（Myo）為催化劑的中空納米反應(yīng)器，通過溫度變化對大鼠腦內(nèi)Glu進行監(jiān)測。（圖片來源：Anal. Chem.）在中空P(MAn-St-NIPAm-PBA)納米反應(yīng)器成功形成后，通過測試其直徑在25-40 ℃之間的變化來研究它的熱響應(yīng)滲透閥。從25 ℃加熱到40 ℃后，空心納米反應(yīng)器的尺寸從21.0 nm減小到16.0 nm。此外，納米反應(yīng)器的直徑在冷卻后恢復(fù)到原來的直徑。這種行為至少在五個周期內(nèi)是可重復(fù)的。結(jié)果表明，納米反應(yīng)器中的可調(diào)閥可以通過改變溫度來控制酶的活性。為了確定空心納米反應(yīng)器的形貌，作者用透射電子顯微鏡（TEM）進行測量。TEM顯示，合成的空心P(MAn-St-NIPAm-PBA)納米反應(yīng)器的總體尺寸約為80-100 nm，為規(guī)則的球形，殼厚約為10-15 nm。酶嵌入前后納米反應(yīng)器的原子力顯微鏡（AFM）圖像表明，納米反應(yīng)器自組裝成高28.6 nm、直徑108.0 nm的膠束，與TEM結(jié)果相似。酶嵌入納米反應(yīng)器后，納米反應(yīng)器的AFM圖像顯示其為高度32.1 nm、直徑123.0 nm的完整球體，略大于空心球形膠束。這些結(jié)果證明P(MAn-St-NIPAm-APBA)成功地形成了膠束型納米反應(yīng)器。根據(jù)溫度調(diào)節(jié)的納米反應(yīng)器的閥可以控制酶和底物的滲透性。圖2.(A)納米反應(yīng)器的熱響應(yīng)特性。(B) (D)空心P(MAn-St-NIPAm-APBA)納米反應(yīng)器的TEM和AFM圖像。(C) (E)含GOx的P(MAn-St-NIPAm-APBA)納米反應(yīng)器的TEM和AFM圖像。（圖片來源：Anal. Chem.）與25 ℃下的酶反應(yīng)相比，在較高溫度（40 ℃）下的游離酶活性略有增加。證明了GOx和Myo兩種酶的串聯(lián)催化反應(yīng)可用于Glu的評價。在納米反應(yīng)器中嵌入GOx和Myo催化劑，隨后添加底物（Glu和愈創(chuàng)木酚）。使用GOx填充和Myo填充納米反應(yīng)器對Glu進行選擇性捕獲和可控傳感。Glu可以被高度選擇性地捕獲并從復(fù)雜的樣品中提取，且通過調(diào)節(jié)pH值（4.0到6.0）釋放。隨后，將GOx填充和Myo填充納米反應(yīng)器應(yīng)用于不同溫度（25或40 °C）下的酶活性研究。在40 °C時，納米反應(yīng)器的閥門為關(guān)，因此未檢測到GOx和Myo催化劑的酶產(chǎn)物，這表明這些酶在納米反應(yīng)器中被完全屏蔽，Glu和愈創(chuàng)木酚不能進入納米反應(yīng)器并被GOx和Myo水解。圖3.采用GOx和Myo填充納米反應(yīng)器進行Glu的選擇性捕獲/釋放和原位可控檢測。（圖片來源：Anal. Chem.）一般來說，對生理上重要物種的高選擇性傳感方法尤為重要。因此作者將該策略應(yīng)用于監(jiān)測生物腦中Glu。該方法采用Glu初始化的串聯(lián)反應(yīng)，并可通過醌的紫外強度變化來測量Glu。為了測定大鼠大腦中的Glu，制備了不同濃度的Glu溶液，并添加了含GOx的納米反應(yīng)器。在25 °C（pH 6.0）下孵育5分鐘后，分離含有GOx的納米反應(yīng)器并轉(zhuǎn)移到pH 4.0的緩沖溶液中。pH值的變化可以降低納米反應(yīng)器表面PBA靶向基團的Glu量。然后，在25 ℃下添加含有Myo和愈創(chuàng)木酚的納米反應(yīng)器溶液。將所得混合物在40 ℃（pH 4.0）下孵育5分鐘，然后檢測紫外光譜，醌強度在470 nm處達到峰值，并隨著Glu濃度在0.30-10.0 mM范圍內(nèi)線性增加的變化而增加，檢測限為0.20 mM，這表明該方法可用于大鼠腦樣品中的Glu傳感，且納米反應(yīng)器在Glu檢測中表現(xiàn)出良好的選擇性和穩(wěn)定性。大鼠全腦缺血(靜息期)術(shù)前2小時收集大鼠腦微透析液標本。術(shù)后20分鐘Glu水平略有下降，術(shù)后2小時Glu水平下降約25.0 %，與以往報道一致，再次說明納米反應(yīng)器材料和“選擇性捕獲和可控檢測”策略對大鼠腦微透析液樣品中Glu的分析是非常有選擇性的。圖4.(A)空心納米反應(yīng)器的溫度響應(yīng)與Glu的線性關(guān)系。(B)靜息、缺血生理條件下大鼠腦微透析液樣品中Glu濃度的變化。（圖片來源：Anal. Chem.）總結(jié)：中國科學(xué)院大學(xué)齊莉課題組利用GOx和Myo催化劑的獨特靶向性和串聯(lián)催化反應(yīng)成功地證明了熱響應(yīng)納米反應(yīng)器在大鼠腦內(nèi)Glu高選擇性檢測中的應(yīng)用。作者通過應(yīng)用熱敏特性以及Glu與嵌段共聚物上立體精確放置的雙硼酸之間的結(jié)合反應(yīng)，使納米反應(yīng)器將成為大鼠腦微透析液樣品中Glu傳感的可靠而有效的材料。該方法不僅為腦微透析液中Glu的選擇性檢測提供了新的策略，而且為研究生理病理事件提供了分析平臺。
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