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2020年5月25日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院雷曉光課題組與合作者中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所戴均貴課題組以及中國中醫(yī)科學(xué)院黃璐琦課題組，在Nature Chemistry雜志上發(fā)表以“FAD-dependent enzyme-catalysed intermolecular [4+2] cycloaddition in natural product biosynthesis”為標(biāo)題的文章，解析了傳統(tǒng)中藥桑白皮中的活性天然產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵步驟，報道了自然界中存在的首例催化分子間Diels-Alder反應(yīng)的單功能酶，為多年來存在的一個重要科學(xué)爭論：“自然界中是否有真正意義的分子間Diels-Alder反應(yīng)酶”畫上了句號。

    植物天然產(chǎn)物作為內(nèi)源性小分子參與了自身重要生理活動，例如調(diào)控植物自身的生長發(fā)育以及抵御病蟲害， 同時也是治療人類重大疾病的創(chuàng)新藥物分子的主要來源。因此，解析植物天然產(chǎn)物的生物合成途徑對于植物生物學(xué)、生態(tài)學(xué)研究、以及開發(fā)創(chuàng)新藥物治療人類重大疾病都具有重要意義。然而由于植物自身的特點(diǎn)（生長緩慢，基因組龐大）以及參與生物合成的基因往往不成簇分布的現(xiàn)象，植物天然生物合成研究方法有限，進(jìn)展緩慢。在本文中，雷曉光課題組開發(fā)出一種基于天然生物合成中間體分子探針（Biosynthetic Intermediate Probes， BIPs）的靶標(biāo)垂釣策略（如圖1所示），并與合作者一起通過結(jié)合植物天然產(chǎn)物生物合成研究中的常規(guī)手段（活性導(dǎo)向蛋白分離以及轉(zhuǎn)錄組測序等方法），成功在桑樹愈傷組織中鑒定出兩個FAD依賴蛋白（MaMO和MaDA），其中MaDA被進(jìn)一步證明為自然界中存在的首個催化分子間Diels-Alder反應(yīng)的單功能酶。該基于“天然產(chǎn)物生物合成中間體分子探針”的化學(xué)生物學(xué)研究策略，為解析植物天然產(chǎn)物生物合成途徑提供了新的研究思路。

圖1，桑樹中D-A類型天然產(chǎn)物可能的生物合成途徑以及基于生物合成中間體探針的靶點(diǎn)垂釣

自1928年，德國化學(xué)家Otto Diels和他的學(xué)生Kurt Alder首次報道了Diels-Alder反應(yīng)（簡稱DA反應(yīng)）（Justus Liebigs Ann. Chem. 1928, 460, 98-122），他們就推測很多天然產(chǎn)物可以通過DA反應(yīng)來構(gòu)建，暗示了在自然界可能存在催化該反應(yīng)的酶：Diels-Alder反應(yīng)酶（Diels-Alderase）。由于DA反應(yīng)是合成化學(xué)中構(gòu)建C-C鍵最常用的方法之一，被廣泛應(yīng)用在天然產(chǎn)物和藥物分子的合成中，因此，Otto Diels和Kurt Alder一起分享了1950年的諾貝爾化學(xué)獎。不過到目前為止，科學(xué)界發(fā)現(xiàn)的Diels-Alderase并不多，以催化分子內(nèi)DA反應(yīng)為主，能催化分子間DA反應(yīng)的酶更是屈指可數(shù)，并且這有限幾種分子間Diels-Alderase并不是只催化分子間DA反應(yīng)，還催化其他化學(xué)反應(yīng)。那么，自然界中是否存在“真正意義”的分子間DA反應(yīng)酶？

在成功鑒定出MaDA后，作者進(jìn)一步探索了其底物適應(yīng)性，并對該酶促分子間Diels-Alder反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行了深入探討。作者通過DFT計算證明了該非酶促的Diels-Alder反應(yīng)是通過協(xié)同但不同步的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行的。隨后通過對該酶促分子間Diels-Alder反應(yīng)進(jìn)行KIE實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該酶促反應(yīng)過程是通過協(xié)同但不同步的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行的，這證明了MaDA是真正意義上的單功能分子間Diels-Alder反應(yīng)酶。為了進(jìn)一步探索MaDA的催化機(jī)制，雷曉光課題組成功解析了MaDA的晶體結(jié)構(gòu)（2.3 ?），在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了分子對接以及定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，F375，R443，F356，I259以及Y192對于維持MaDA的活性至關(guān)重要，同時，作者還發(fā)現(xiàn)氧化態(tài)的FAD對于MaDA的活性也非常重要，如圖2所示。

圖2：基于MaDA晶體結(jié)構(gòu)的分子對接以及點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)揭示了MaDA與底物形成相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)

綜上所述，研究者通過活性導(dǎo)向蛋白分離，基于生物合成中間體探針（BIPs）的靶點(diǎn)垂釣和轉(zhuǎn)錄組分析相結(jié)合的策略成功在桑樹愈傷組織中鑒定了兩個FAD依賴的蛋白， MaMO和MaDA。其中，MaDA為首例催化分子間[4+2]環(huán)化反應(yīng)的單功能酶。作者通過DFT以及KIE實(shí)驗(yàn)證明了該酶促反應(yīng)為協(xié)同但不同步的Diels-Alder反應(yīng)，因此MaDA是首個從自然界中發(fā)現(xiàn)的、催化分子間反應(yīng)的Diels-Alder反應(yīng)酶，從而結(jié)束了學(xué)術(shù)界一直存在的“自然界是否有真正意義DA反應(yīng)酶”的爭論。作者還成功解析了MaDA的晶體結(jié)構(gòu)，并初步闡明了底物和蛋白相互作用的機(jī)制。此外，MaDA有很好的底物寬泛性，利用MaDA實(shí)現(xiàn)了多種D-A類型天然產(chǎn)物的酶法合成。該酶法合成展現(xiàn)出普通化學(xué)方法難以實(shí)現(xiàn)的高效性與立體化學(xué)專一性，體現(xiàn)了MaDA在生物催化中的優(yōu)勢和特點(diǎn)，為發(fā)展酶催化合成方法來高效制備結(jié)構(gòu)多樣的功能有機(jī)分子開辟了新的研究方向。此外，本研究所提出的基于天然產(chǎn)物生物合成中間體分子探針（BIPs）靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的化學(xué)生物學(xué)研究手段也會為闡明天然產(chǎn)物生物合成途徑、發(fā)現(xiàn)新穎的生物合成酶提供新的研究方法與思路。最后，該類藥用植物來源天然產(chǎn)物生物合成途徑的解析也為后繼合成途徑重建，實(shí)現(xiàn)植物天然產(chǎn)物的微生物異源生物合成，并開展結(jié)構(gòu)衍生化研究，提升功能活性鋪平了道路。

在本工作中，雷曉光課題組高磊博士，戴均貴課題組蘇聰博士，雷曉光課題組杜曉霞博士以及黃璐琦課題組王瑞杉博士為共同第一作者。北京大學(xué)雷曉光教授，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所戴均貴研究員以及中國中醫(yī)研究院黃璐琦研究員為共同通訊作者。北京生命科學(xué)研究所的周宇博士和黃牛研究員以及UCLA的Chen Shuming博士和K. N. Houk教授在計算模擬，DFT計算方面做出了重要貢獻(xiàn)。此外，北京生命科學(xué)研究所的陳涉研究員，中國中醫(yī)科學(xué)院的郭蘭萍研究員，北海道大學(xué)的Oikawa教授，Minami副教授以及劉成偉助理教授，以及帝京平成大學(xué)的Hano教授和Shimazaki教授也在質(zhì)譜分析，轉(zhuǎn)錄組分析以及酶活測試等方面提供了重要幫助。該工作得到國家自然科學(xué)基金，國家科技部重點(diǎn)研究發(fā)展計劃，北京市“卓越青年科學(xué)家計劃”，北京分子科學(xué)國家研究中心，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等多個國家重大科研項(xiàng)目和研究機(jī)構(gòu)的資助。高磊博士目前得到了北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心杰出博士后基金的資助。

FAD-dependent enzyme-catalysed intermolecular [4+2] cycloaddition in natural product biosynthesis

Lei Gao,# Cong Su, # Xiaoxia Du, # Ruishan Wang,# Shuming Chen, Yu Zhou, Chengwei Liu, Xiaojing Liu, Runze Tian, Liyun Zhang, Kebo Xie, She Chen, Qianqian Guo, Lanping Guo, Yoshio Hano, Manabu Shimazaki , Atsushi Minami, Hideaki Oikawa, Niu Huang, K. N. Houk, Luqi Huang,* Jungui Dai,* Xiaoguang Lei*

Nature Chemistry 2020, DOI: 10.1038/s41557-020-0467-7

https://doi.org/10.1038/s41557-020-0467-7