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　　DNA甲基化可以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)等相互作用，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化可隨DNA的復(fù)制過(guò)程遺傳給新生的子代DNA，是一種重要的表觀遺傳機(jī)制。在染色質(zhì)環(huán)境中，DNA的甲基化要比在溶液中復(fù)雜得多，核小體作為遺傳物質(zhì)的組成單位，包裹在其外圍的DNA更加難以被甲基化。然而，大多數(shù)核小體結(jié)合的de novo DNA甲基轉(zhuǎn)移酶處于非激活狀態(tài)。de novo DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶3A和3B催化的CpG甲基化對(duì)哺乳動(dòng)物的發(fā)育和細(xì)胞分化至關(guān)重要，并且常常與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)大量正常組織（GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)）和癌癥組織（TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)）中不同亞型DNMT的表達(dá)分析，本研究以人類癌癥中主要的兩種DNMT亞型DNMT3A2和DNMT3B3與核小體核的相互作用為重點(diǎn)。目前，DNMT3A催化結(jié)構(gòu)域和DNMT3L類催化結(jié)構(gòu)域以及其與游離DNA的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析，然而由于其局限性， DNMT與其天然底物核小體的相互作用機(jī)制并未得到闡述。

　　中科院上海藥物研究所徐華強(qiáng)課題組聯(lián)合美國(guó)溫安洛研究所Peter Jones課題組、Karsten Melcher課題組，長(zhǎng)期致力于研究DNA 甲基化對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的重要影響及其對(duì)人類癌癥發(fā)生發(fā)展的廣泛參與。為了揭示DNMT3A2/3B3與核小體的相互作用并了解染色體上DNA甲基化，通過(guò)四年多的不懈努力，團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡技術(shù)成功解析DNMT3A2/3B3和核小體復(fù)合物近原子分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)顯示，異源四聚體復(fù)合物（3B3-3A2-3A2-3B3）與分離的DNMT3A催化結(jié)構(gòu)域和DNMT3L類催化結(jié)構(gòu)域復(fù)合物非常相似，但是卻非對(duì)稱地和核小體相互作用。DNMT3B3類催化結(jié)構(gòu)域之一錨定在核小體的酸性補(bǔ)?。╝cidic patch）區(qū)域，其作用核心區(qū)域?yàn)镈NMT3B3 740位和743位的精氨酸指（Arginine finger）。核小體酸性補(bǔ)丁區(qū)域與多種核小體結(jié)合蛋白都有至關(guān)重要的相互作用。然而，DNMT3A2催化結(jié)構(gòu)域并不與核小體核心區(qū)域相互作用，而是隨著DNA的路徑，與一端的連接DNA（linker DNA）相互作用并催化其CpG甲基化。盡管DNMT3家族蛋白具有高度的保守性，通過(guò)DNA結(jié)合的DNMT3A2和核小體核心區(qū)域結(jié)合的DNMT3B3的結(jié)構(gòu)對(duì)比，揭示了目標(biāo)識(shí)別區(qū)域（TRD）結(jié)構(gòu)域的開(kāi)關(guān)功能。在所有具有催化活性的DNMT3亞型中，都含有對(duì)目標(biāo)DNA作用至關(guān)重要的TRD結(jié)構(gòu)域，雖然其在空間上阻斷了催化結(jié)構(gòu)域與核小體核心區(qū)域相互作用，但是增強(qiáng)了DNA的結(jié)合能力。

　　a, 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的冷凍電鏡電子密度圖； b, 酸性補(bǔ)丁相互作用； c, DNMT3A2 催化結(jié)構(gòu)域與連接DNA相互作用和DNMT3B3類催化結(jié)構(gòu)域與核小體核心相互作用。

　　為了驗(yàn)證酸性補(bǔ)丁相互作用對(duì)核小體募集的重要性，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)精氨酸指（R740和R743）進(jìn)行了突變分析，并以遠(yuǎn)離酸性補(bǔ)丁區(qū)域的氨基酸（K745和R749）作為對(duì)照。體外相互作用實(shí)驗(yàn)（ALPHA Screen）顯示，相互作用核心區(qū)域740和743精氨酸指相反電荷的突變顯著減弱了DNMT3A2/3B3與核小體的相互作用，而非核心區(qū)域或者相同電荷的突變則如預(yù)期，結(jié)合能力沒(méi)有顯著變化。細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)（chromatin association assay）也證實(shí)與酸性補(bǔ)丁相互作用740和743精氨酸指的突變導(dǎo)致與染色質(zhì)的結(jié)合顯著降低。DNA甲基化陣列（Infinium MethylationEPIC BeadChip）同樣證實(shí)了DNMT3B3與核小體酸性補(bǔ)丁之間的相互作用對(duì)于體內(nèi)DNA甲基化重建的重要性。突變體DNMT3B3恢復(fù)DNA甲基化的能力和其與染色質(zhì)的結(jié)合能力密切相關(guān)。作為對(duì)照的K745和R749突變，甲基化恢復(fù)水平幾乎與野生型DNMT3B3一樣。相反，顯著降低與染色質(zhì)結(jié)合的R740E和R743E突變，甲基化恢復(fù)效率低得多。有限的微球菌核酸酶消化實(shí)驗(yàn)（MNase digestion）進(jìn)一步證實(shí)了存在DNMT復(fù)合物的情況下，核小體的任一側(cè)都顯著增加了約10 堿基對(duì)的保護(hù)區(qū)域。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持DNMT復(fù)合物的類催化結(jié)構(gòu)域與酸性補(bǔ)丁相互作用對(duì)于核小體募集和DNA甲基化的重要性，并且與DNA的結(jié)合并不依賴于酶的活性位點(diǎn)CpG。

　　a AlphaScreen實(shí)驗(yàn)測(cè)定His標(biāo)記的DNMT3A2-DNMT3B3復(fù)合物與生物素標(biāo)記的NCP相互作用。b. DNMT3 染色質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

c. HCT116細(xì)胞和DKO8共轉(zhuǎn)DNMT3B3細(xì)胞的CpG位點(diǎn)的甲基化熱圖。d. 箱形圖顯示了109,998個(gè)探針的DNA甲基化水平分布。

　　總之，DNMT3A2/3B3與核小體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)以及功能分析揭示了DNMT3B3類催化結(jié)構(gòu)域出乎意料的核小體靶向功能，將DNMT3A2/3B3催化結(jié)構(gòu)域定位在核小體連接DNA區(qū)域，這對(duì)于全基因組DNA甲基化非常重要。通過(guò)DNMT類催化結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域?qū)NMT核心核小體靶向和CpG甲基化分離，可以將DNMT3復(fù)合物募集到難以接近的核小體附近，同時(shí)將CpG甲基化靶向連接DNA區(qū)域。這表明，在體內(nèi)將DNA甲基化傳播至核小體DNA需要核小體核的重塑，例如通過(guò)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或其他核小體重塑事件。

　　該項(xiàng)工作由2016年作為藥物所和溫安洛的交流生徐廷海（藥物所2017屆博士畢業(yè)生，目前為美國(guó)溫安洛研究所Peter Jones組、Karsten Melcher組共同博士后）在藥物所導(dǎo)師徐華強(qiáng)和溫安洛Peter Jones、Karsten Melcher的指導(dǎo)下開(kāi)展，徐廷海為本文的唯一第一作者。參與此項(xiàng)工作的還有溫安洛研究所Minmin Liu博士，X. Edward Zhou博士，Gongpu Zhao博士以及南加州大學(xué)的Gangning Liang教授。中國(guó)科學(xué)院上海藥物所徐華強(qiáng)與美國(guó)溫安洛研究所Peter Jones，Karsten Melcher為本文的共同通訊作者。

　　文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-020-2747-1