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第二個(gè)近紅外窗口（NIR-II，1000-1700 nm）中的熒光團(tuán)由于比第一個(gè)近紅外窗口（NIR-I，650-900 nm）具有更好的成像質(zhì)量和更深的組織穿透力而受到廣泛關(guān)注。目前，NIR-II熒光團(tuán)主要以無機(jī)納米材料為基礎(chǔ)，但其有爭(zhēng)議的毒性阻礙了其臨床前的轉(zhuǎn)化。相比之下，有機(jī)小分子染料，如亞甲基藍(lán)和吲哚青綠（ICG），已呈現(xiàn)出令人滿意的安全性，并已在臨床上使用多年。因此，有機(jī)熒光團(tuán)是體內(nèi)成像的首選。到目前為止，NIR-II型有機(jī)小分子熒光團(tuán)主要有兩種類型。一種是聚甲基，但其斯托克斯位移有限，化學(xué)穩(wěn)定性差。另一類熒光團(tuán)具有給體-受體-給體（D-A-D）特性，一個(gè)典型的例子是苯并[1,2-c:4,5-c′]雙( [1,2,5]噻二唑)（BBTD）衍生物。與聚甲基硅氧烷相比，D-A-D熒光團(tuán)在體內(nèi)表現(xiàn)出更大的斯托克斯位移（>200 nm）和更高的信號(hào)背景比成像。但是現(xiàn)有的基于BBTD的熒光團(tuán)在體成像的最大吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別在800和1000 nm左右，仍然比較短。因此，開發(fā)具有更長(zhǎng)波長(zhǎng)的新型熒光團(tuán)是非常需要的，這實(shí)際上是光譜探針領(lǐng)域最重要的前沿課題之一。

為此，作者研究了目前構(gòu)建基于BBTD的NIR-II熒光團(tuán)的方法，發(fā)現(xiàn)在BBTD骨架中用硒取代硫原子可以增加分析波長(zhǎng)；另一方面，引入給電子氨基也可以延長(zhǎng)波長(zhǎng)。然而，這些措施只會(huì)導(dǎo)致波長(zhǎng)紅移≤50 nm，如何進(jìn)一步增加波長(zhǎng)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。在本研究中，作者同時(shí)在BBTD骨架中引入一個(gè)硒原子和一個(gè)氨基，設(shè)想這樣的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致波長(zhǎng)的大幅增加。通過這種設(shè)計(jì)，作者研制了一種新型的有機(jī)小分子熒光團(tuán)FM1210，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為1210 nm，并與硫取代類似物CF1065的光譜特性和圖像質(zhì)量進(jìn)行了比較。值得注意的是，F(xiàn)M1210在發(fā)射波長(zhǎng)上顯示出145 nm的大紅移，量子產(chǎn)率和亮度相當(dāng)；這個(gè)波長(zhǎng)增益大約是BBTD衍生物單次修飾所獲得的（～50 nm）的3倍。超過1200 nm的波長(zhǎng)大幅增加可歸因于硒原子和氨基的協(xié)同作用，從而使使用FM1210的活體成像質(zhì)量比CF1065高得多。這些優(yōu)點(diǎn)進(jìn)一步使NIR-II熒光成像能夠以100 fps的速度對(duì)整個(gè)小鼠身體進(jìn)行。此外，作者還證明了納米級(jí)的FM1210脂質(zhì)體（FM1210-NPs）可以應(yīng)用于腫瘤及其血管系統(tǒng)的高信號(hào)背景比的活體成像。

圖1.近紅外熒光團(tuán)FM1210和CF1065的結(jié)構(gòu)（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

比較了FM1210與CF1065的吸收光譜和熒光光譜。FM1210在CH₂Cl₂中在980 nm處顯示一個(gè)強(qiáng)吸收峰，在1210 nm處顯示一個(gè)熒光峰（量子產(chǎn)率0.036%）。相比之下，CF1065的吸收峰和熒光峰分別出現(xiàn)在855 nm和1065 nm處，量子產(chǎn)率為0.041%。FM1210的大紅移可能是由于重原子和引入的氨基在調(diào)節(jié)能隙方面的協(xié)同作用。為了深入了解結(jié)構(gòu)與波長(zhǎng)之間的關(guān)系，作者研究了四種不同結(jié)構(gòu)的類似物的光譜性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)FM1210中硒原子和氨基同時(shí)存在有利于大波長(zhǎng)紅移。這與對(duì)能隙的理論計(jì)算是一致的。

圖2. FM1210和CF1065在不同溶劑中的吸收光譜以及FM1210和CF1065在980和808 nm激發(fā)下的熒光光譜（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

另一方面，F(xiàn)M1210和CF1065在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中表現(xiàn)出微弱的熒光（量子產(chǎn)率<0.01%）。然而，將這些染料添加到含有白蛋白的胎牛血清（fbs）或pbs中會(huì)產(chǎn)生顯著的熒光，這可能是由于染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。此外，fm1210和cf1065在fbs中是穩(wěn)定的。以上結(jié)果表明染料可能有利于血管成像。還發(fā)現(xiàn)，fbs和白蛋白可引起cf1065和fm1210的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移。< span="">

FM1210優(yōu)越的光譜特性，低細(xì)胞毒性和無明顯器官損傷，啟發(fā)作者探索其在活體熒光成像中的應(yīng)用。首先，對(duì)同一只BALB/c裸鼠在808 nm和980 nm激發(fā)下的自身熒光進(jìn)行了測(cè)定。在相同的激發(fā)功率和曝光時(shí)間（ET）下，980 nm下的自熒光明顯弱于808 nm下的自熒光，說明較長(zhǎng)的波長(zhǎng)可以有效地降低自熒光。

靜脈注射FM1210或CF1065后，可觀察到明顯的血管熒光。仔細(xì)檢查發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)M1210的血管顯示出比CF1065更高的分辨率；放大后的腹部血管圖像更清晰。放大后的股骨血管圖像也顯示出FM1210的對(duì)比度有所改善。此外，從股骨血管橫截面線的熒光強(qiáng)度分析顯示有四條血管存在。結(jié)果表明，F(xiàn)M1210可顯著提高活體成像的信號(hào)背景比。進(jìn)一步研究了FM1210在小鼠血液循環(huán)和尿液排泄中的熒光動(dòng)力學(xué)。FM1210在血液循環(huán)和尿液排泄中的半衰期分別為4.6±0.2 h和1.6±0.2 h。

圖3.攜帶FM1210和CF1065的BALB/c裸鼠的代表性NIR-II熒光圖像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

由于體內(nèi)穿透深度有限，用NIR-I染料很難獲得高質(zhì)量的視頻。在這里，作者使用FM1210，對(duì)一只麻醉老鼠的全身進(jìn)行高速成像。即使分辨率為640×512像素，作者也可以以100 fps的速度獲得清晰的NIR-II視頻，這可能是NIR-II成像速率最高的。通過這段視頻，作者測(cè)量到每分鐘234次心跳。值得注意的是，心房搏動(dòng)和心室搏動(dòng)之間約0.12秒的細(xì)微延遲可以通過高速成像得到解決。作者還用同樣的方法對(duì)處于非麻醉狀態(tài)的老鼠進(jìn)行了成像，并測(cè)量到每分鐘大約420次的心率。因此，F(xiàn)M1210可能為心臟研究提供一種有前途的方法。

圖4.高速成像麻醉小鼠靜脈注射FM1210（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

腫瘤成像迫切需要具有被動(dòng)靶向能力、良好水溶性和生物相容性的熒光納米粒子。因此進(jìn)一步將FM1210包封于脂質(zhì)體中，得到納米級(jí)的FM1210（FM1210-NPs），其含量為2.6±1.2%（w/w），粒徑為20-22 nm。在PBS中，F(xiàn)M1210-NPs比FM1210具有更強(qiáng)的熒光。重要的是，F(xiàn)M1210納米顆粒顯示出至少24小時(shí)的高穩(wěn)定性、低細(xì)胞毒性和更好的水溶性。FM1210-NPs在血液循環(huán)和尿液排泄中的半衰期分別為5.7±0.4 h和2.3±0.3 h，表明其體內(nèi)滯留時(shí)間比FM1210長(zhǎng)。荷瘤小鼠尾靜脈注射FM1210-NPs后，腫瘤血管結(jié)構(gòu)豐富而精細(xì)，其中擴(kuò)張的血管和毛細(xì)血管易于區(qū)分。腫瘤內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的推移先增加后降低，這是由于FM1210-NPs在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化所致。且FM1210-NPs在腫瘤內(nèi)有蓄積的趨勢(shì)，腫瘤與正常組織的熒光比值最高出現(xiàn)在4 h，另外，24 h后，體外生物分布證實(shí)FM1210-NPS在腫瘤區(qū)域有效富集，這可能是被動(dòng)靶向所致納米顆粒的能力。另一方面，用FM1210進(jìn)行了等效研究，發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)并不集中在腫瘤區(qū)域。這些觀察結(jié)果表明納米級(jí)的FM1210納米顆?？赡軐?duì)腫瘤研究有用。

圖5.FM1210-NPs的腫瘤熒光成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結(jié)：總之，目前用于體內(nèi)成像的小分子熒光團(tuán)在1100 nm處熒光發(fā)射最大，而中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所馬會(huì)民、史文課題組的新FM1210在1210 nm處熒光發(fā)射最大。與CF1065相比，F(xiàn)M1210的波長(zhǎng)增加了145 nm更是一個(gè)很大的進(jìn)步，這主要是由于硒原子和氨基的結(jié)合。且FM1210比CF1065顯示更低的背景，更好的分辨率和更高的信號(hào)背景比。使用FM1210，作者已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了100幀每秒的高速NIR-II成像。此外，F(xiàn)M1210-NPs還能成像腫瘤甚至其血管系統(tǒng)?？偟膩碚f，在體內(nèi)成像中，F(xiàn)M1210比之前的小分子染料表現(xiàn)出了優(yōu)勢(shì)。

撰稿人：馮虹