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在這篇論文中，他們首次報道了迄今整體研究知之甚少的次要剪接體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)，展示了在剪接反應(yīng)中的一個關(guān)鍵構(gòu)象——激活態(tài)次要剪接體（activated minorspliceosome，定義為“次要B^act復(fù)合物”），整體分辨率高達(dá)2.9埃。該結(jié)構(gòu)第一次展示了人源次要剪接體的組成、以及對稀有內(nèi)含子（U12依賴型內(nèi)含子）的識別機(jī)理，首次揭示了次要剪接體的催化中心以及活性位點(diǎn)，并且通過結(jié)構(gòu)解析鑒定了次要剪接體的全新蛋白組分、揭示了它們對次要剪接體及罕見內(nèi)含子剪接的重要作用等一系列重要科學(xué)問題。

此次重大突破，使施一公研究組在繼2015年首次解析世界上第一個剪接體結(jié)構(gòu)、2017年解析第一個人源剪接體結(jié)構(gòu)之后，再次成為世界上首個解析了次要剪接體高分辨率三維結(jié)構(gòu)的團(tuán)隊(duì)。

圖1 施一公研究組最新《科學(xué)》長文

在高等生物中，一段又一段的遺傳密碼埋在核酸分子中。其中，“無效”的遺傳信息不具有翻譯功能，被稱為內(nèi)含子，而可以被核糖體翻譯的有效遺傳信息叫做外顯子。把這些遺傳密碼中“無效”的內(nèi)含子“剪”出來，“有效”的外顯子“接”到一起的過程叫做RNA剪接，它是生命體解讀遺傳密碼的核心步驟。負(fù)責(zé)執(zhí)行這一步驟的就是細(xì)胞核內(nèi)復(fù)雜精密的分子機(jī)器——剪接體。每個細(xì)胞對于每一條剪接前的基因信使——前體信使RNA的剪接在時空上是非常精準(zhǔn)的。剪掉誰，剪掉多長，什么時候剪，按照什么順序把外顯子拼接起來，每一個“操作”都是可能改變細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵問題。一步走錯，結(jié)果千差萬別，基因的表達(dá)和傳遞也會因此出現(xiàn)錯誤，于是就導(dǎo)致了人類某些先天遺傳疾病以及后天疑難雜癥的出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，人類的遺傳疾病大約有35%都是因?yàn)榧艚赢惓Ｔ斐傻摹?/strong>從1977年首次發(fā)現(xiàn)RNA剪接至本世紀(jì)初，科學(xué)家們通過免疫沉淀、基因敲除、交聯(lián)質(zhì)譜、建立體外剪接反應(yīng)系統(tǒng)等研究手段，初步建立起剪接體的組裝、激活與解聚的發(fā)生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調(diào)控等復(fù)雜的RNA剪接調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

20世紀(jì)90年代，科學(xué)家在對高等真核生物內(nèi)含子序列的研究分析中，發(fā)現(xiàn)了一類非經(jīng)典的內(nèi)含子剪接序列（5’剪接位點(diǎn)為AT，3’剪接位點(diǎn)為AC），一種全新的剪接體開始逐漸進(jìn)入科學(xué)家的視野。在隨后的研究中，科學(xué)家們逐漸確定了這個全新剪接體的核酸組成，其中U11、U12、U4atac、U6atac四種新的snRNA參與該類內(nèi)含子的識別與剪接。由于這種非經(jīng)典的內(nèi)含子占比不足百分之一，該類內(nèi)含子被稱作稀有內(nèi)含子，而因其特殊的剪接位點(diǎn)及識別該位點(diǎn)的特殊snRNA組分，該類內(nèi)含子又被命名為AT-AC內(nèi)含子（AT-AC intron）或U12依賴型內(nèi)含子（U12-type intron），催化該類內(nèi)含子剪接的這種全新剪接體被命名為次要剪接體（minor spliceosome）。盡管由次要剪接體進(jìn)行剪接的稀有內(nèi)含子含量極低，但是這些基因卻與許多重要的細(xì)胞基本生命活動密切相關(guān)，比如DNA的復(fù)制與修復(fù)、RNA轉(zhuǎn)錄與翻譯等等。然而，對于U12依賴型內(nèi)含子以及次要剪接體的研究卻發(fā)展緩慢，次要剪接體的蛋白組成、重塑調(diào)控等等關(guān)鍵的科學(xué)問題，一直沒有答案。其中非常重要的一步——如何捕獲并純化次要剪接體，是領(lǐng)域內(nèi)面臨的一個巨大難題。

施一公研究組一直致力于剪接體的三維結(jié)構(gòu)與RNA剪接分子機(jī)理的研究，自2015年報道了第一個剪接體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)后，相繼解析了釀酒酵母和人源主要剪接體（major spliceosome）的全部已被鑒定的基本構(gòu)象。這些已解析的剪接體覆蓋了整個RNA剪接循環(huán)，從分子層面揭示了剪接體催化RNA剪接兩步反應(yīng)的工作機(jī)理，同時為理解剪接體的組裝、激活和解聚等過程的發(fā)生提供結(jié)構(gòu)依據(jù)，首次將剪接體介導(dǎo)的RNA剪接過程完整的串聯(lián)起來，為理解RNA剪接的分子機(jī)理提供了最清晰、最全面的結(jié)構(gòu)信息（圖2）。與此同時，施一公研究組也將目光聚焦在了研究更為匱乏的次要剪接體研究領(lǐng)域。

圖2施一公研究組解析的剪接體結(jié)構(gòu)匯總

（圖片來源: Wan et.al, 2020, Annu Rev Biochem）

在沒有任何次要剪接體的捕獲與純化等相關(guān)文獻(xiàn)的情況下，摸索并建立次要剪接體的捕獲與純化方法迫在眉睫。施一公研究組的白蕊博士與萬蕊雪博士，長期從事剪接體的純化與結(jié)構(gòu)研究工作，并積累了大量剪接體結(jié)構(gòu)研究的經(jīng)驗(yàn)。在此研究經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，結(jié)合次要剪接體識別位點(diǎn)的特異性，研究組首次設(shè)計(jì)出一條全新的U12依賴型的pre-mRNA。通過改良前人的體外剪接反應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件，成功地確定了該U12依賴型的pre-mRNA具有極高的特異性與剪接的高效性。由于次要剪接體的含量極低，如何進(jìn)一步獲得性質(zhì)良好的次要剪接體樣品，成為本文研究的第二大難點(diǎn)。白蕊和萬蕊雪在原有的剪接體純化基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步探索與改良，最終首次建立起一套完整的次要剪接體捕獲與純化方法，成功獲得了處于激活態(tài)的次要剪接體的蛋白樣品，隨后利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出了世界上首個次要剪接體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，整體分辨率為2.9埃，并搭建了第一個次要剪接體的原子模型，其中包含了4條RNA和45個蛋白（圖3）。

圖3人源次要剪接體的三維結(jié)構(gòu)

該文解析的人源次要剪接體B^actcomplex結(jié)構(gòu)，首次觀察到了次要剪接體特有組分U6atac snRNA和U12 snRNA的三維結(jié)構(gòu)，揭示了識別U12-type內(nèi)含子剪接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，第一次展示了次要剪接體活性位點(diǎn)和催化中心的三維結(jié)構(gòu)。在次要剪接體的活性位點(diǎn)中，兩個具有關(guān)鍵作用的催化鎂離子被周圍的RNA配位結(jié)合，為剪接反應(yīng)的發(fā)生提供了基礎(chǔ)。該結(jié)構(gòu)的成功解析，首次鑒定出了5個全新的蛋白組分，它們參與組成次要剪接體因此在U12依賴型內(nèi)含子的剪接中起重要作用。SCNM1、CRIPT為U12 snRNP的特有組分，參與識別和穩(wěn)定內(nèi)含子上的剪接位點(diǎn)；RBM48與ARMC7形成復(fù)合物，結(jié)合在U6atac snRNA的5’末端，結(jié)合并保護(hù)U6atac snRNA特有的γ-甲基磷酸帽結(jié)構(gòu)，起到穩(wěn)定U6atac snRNA構(gòu)象的作用。此外，參與泛素化通路的PPIL2蛋白在剪接體中的結(jié)構(gòu)首次解析，該蛋白深入次要剪接體的活性位點(diǎn)，與U5 snRNA有直接的相互作用，參與穩(wěn)定U5 snRNP以及次要剪接體的催化中心。值得一提的是，在主要剪接體激活過程中起關(guān)鍵作用的“動力驅(qū)動”蛋白Prp2及其激活因子Spp2，也以類似的方式結(jié)合到次要剪接體中，這是Prp2同時也在次要剪接體中起作用的第一個支持性證據(jù)。由此不難推斷，推動主要剪接體進(jìn)行結(jié)構(gòu)重塑的數(shù)個ATPase也參與次要剪接體不同構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)變與重塑中，即次要剪接體與主要剪接體之間共享結(jié)構(gòu)重塑蛋白因子（圖4）。該文作為第一篇揭示人源次要剪接體的結(jié)構(gòu)研究，文中建立的捕獲與純化次要剪接體的方法、鑒定的參與次要剪接體的組成的全新蛋白等，都將對U12依賴型的RNA剪接分子機(jī)理的研究產(chǎn)生重要影響。

圖4次要剪接體與主要剪接體的結(jié)構(gòu)差異

西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院施一公教授、西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西湖學(xué)者萬蕊雪博士為本文的共同通訊作者；西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后白蕊和西湖學(xué)者萬蕊雪為本文的共同第一作者；清華大學(xué)生命學(xué)院博士后王琳參與了部分生化研究；清華大學(xué)生命學(xué)院博士生徐魁、清華大學(xué)生命學(xué)院張強(qiáng)鋒研究員為結(jié)構(gòu)模型的搭建提供了幫助；清華大學(xué)冷凍電鏡平臺主管雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學(xué)冷凍電鏡平臺，計(jì)算工作得到清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺、國家蛋白質(zhì)設(shè)施實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心（北京）的支持。本項(xiàng)研究成果來自于西湖實(shí)驗(yàn)室，獲得了西湖教育基金會、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心（清華）及國家自然科學(xué)基金委的經(jīng)費(fèi)支持。

參考資料

[1] 西湖大學(xué)，重大突破！西湖大學(xué)施一公研究組在《科學(xué)》發(fā)文 報道首個人源次要剪接體的電鏡結(jié)構(gòu)，https://www.westlake.edu.cn/news_events/westlakenews/academics/202101/t20210129_8086.shtml

[2] 論文鏈接：https://science.sciencemag.org/content/early/2021/01/27/science.abg0879