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周期蛋白依賴性激酶(CDK)是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有較短的N末端(β-折疊)和較長的C末端(a-螺旋)。CDK通過與相應周期蛋白cyclin和周期蛋白依賴性激酶激活激酶(CAK)產生相互作用，在細胞周期的各個階段發(fā)揮作用，參與細胞的生長、分化、增殖等生理過程，介導細胞周期的有序進行。CDK2是CDK家族的一員，廣泛表達于哺乳動物細胞內，但其功能可被其它CDK家族成員代償，因此對于大多數正常細胞和組織CDK2是非必須的。然而，在腫瘤發(fā)生、細胞分化、減數分裂和聽力損傷修復等過程中CDK2卻發(fā)揮著重要功能，近年來的研究發(fā)現CDK2敲降可誘導AML細胞產生分化。然而，傳統(tǒng)的小分子抑制劑難以實現選擇性的CDK2抑制，也不能消除CDK2的非酶活功能，藥效不足且副作用嚴重?；蚓庉嫾夹g則在應用效率和臨床使用中存在諸多不足。雖然認為CDK2是良好的藥靶，但現有工具難以對其實現高效的選擇性調控。

PROTAC技術是一種利用小分子誘導靶蛋白泛素化，利用泛素化蛋白酶體途徑實現靶向蛋白敲降的技術。PROTAC由靶蛋白配體、E3泛素連接酶配體和連接鏈Linker構成(圖1)。該小分子可誘導該靶蛋白與E3泛素連接酶相互作用，從而實現靶蛋白的非天然泛素化，被泛素化的靶蛋白進一步被蛋白酶體識別而降解。PROTAC技術實現的降解不僅依賴于小分子的親和力，也需要靶蛋白和E3泛素連接酶在空間上的特異性相互作用。因此，在合理設計和充分優(yōu)化的條件下，PROTAC技術與傳統(tǒng)小分子抑制劑相比較在理論上可實現更好的選擇性。目前高選擇性CDK2敲降PROTAC分子還未有文獻報道。

圖1. PROTAC技術的原理

如何實現CDK2的選擇性敲降是這篇工作中作者解決的核心技術問題。親和力水平是PROTAC發(fā)揮功能的基礎，為保持與CDK2蛋白的親和力，研究者對分子結構進行了充分的模擬，與CDK2存在重要相互作用的結構單元需保留而暴露于溶劑區(qū)的位點則用于Linker延伸，這樣的設計可最大程度的保留與CDK2的親和力水平，而降低與非靶向蛋白的親和力。歷經多輪迭代設計與分子結構優(yōu)化，最終基于篩選出的配體，成功發(fā)展出以J2為配體的CDK2選擇性降解劑CPS2(圖2)。

圖2.CDK2降解劑的設計、優(yōu)化和活性

研究者開發(fā)的這類新型CDK2降解劑有以下特點。適用范圍廣：在這篇工作中，作者嘗試測試了10余種細胞系，CPS2均可在納摩爾濃度下實現對CDK2有效敲降。選擇性佳：較小分子抑制劑，CPS2的選擇性有顯著提升。作者運用了激酶組學、激酶活性測試、蛋白質組學和western blot等試驗，證明了當使用CPS2處理細胞時，在可觀測的蛋白范圍內，CDK2的降解最為顯著，而對其它蛋白沒有顯著影響(圖3)。

圖3. CPS2在多種細胞系內誘導CDK2的高效選擇性降解

CPS2解決了CDK2抑制劑選擇性的問題，對正常細胞(Beas2b、293T細胞系)的毒性較小，但CPS2可通過抑制腫瘤細胞增殖的方式產生抗腫瘤效果(圖4)。作者也進行了在動物體內急毒實驗，結果表明CPS2的安全性遠高于其母核抑制劑J2(圖5)。

圖4. CPS2對正常細胞影響較小，但可阻滯腫瘤細胞快速增殖

圖5. CPS2的體內安全性較高

研究者將CPS2進一步應用于AML分化治療中。在CPS2處理下，AML細胞的分化指標顯著升高，細胞形態(tài)更成熟(圖6)。同時，作者進行了多組Rescue實驗，證明了CPS2通過引起細胞內CDK2的降解執(zhí)行分化誘導功能。為充分論證CPS2作為CDK2選擇性降解劑在AML臨床治療上的重要意義，研究者采集了多株AML病人原代細胞，并加入CPS2進行處理。結果表明，原代細胞在藥物的處理下也可產生明顯分化，充分證明了CPS2的潛在臨床應用意義。

圖6. CPS2處理下，AML細胞產生明顯分化

圖7. CPS2的功能特色

在該工作中，研究者開發(fā)了一類CDK2選擇性降解劑，并初步研究了該分子的安全性和有效性。研究者將這項新的發(fā)現應用于AML分化治療領域，為AML治療提供了一種潛在的高效、低毒的新型治療方案(圖7)。除AML治療外，該類降解劑或可在CDK2相關的其它疾病治療領域也發(fā)揮重要功能。
清華大學博士生王立國、浙江大學博士后邵雪晶、清華大學博士生鐘天白、清華大學博士生吳越和浙江大學博士生許愛笑為該工作共同第一作者，清華大學 饒燏教授和浙江大學應美丹教授為共同通訊作者。該研究得到了清華大學吳畏教授、陶慶華教授、李海濤教授、中國科學院北京基因組研究所王前飛教授的大力幫助。該研究得到了中國國家自然科學基金會、國家重大科技專項“重大新藥開發(fā)”和國家重點研發(fā)計劃的大力支持。

參考資料

[1] 最新研究成果 | 清華大學饒燏團隊與浙江大學應美丹團隊在《Nature Chemical Biology》發(fā)表CDK2降解劑的設計及在AML分化治療中的應用研究http://www.sps.tsinghua.edu.cn/cn/news/achievement/2021/0305/718.html

[2] 論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41589-021-00742-5