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基于β-拉帕醌特異性誘發(fā)癌細(xì)胞ROS擴(kuò)增策略，實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞/組織的高對(duì)比度熒光診斷

癌細(xì)胞的主要代謝方式是糖酵解，這種產(chǎn)能方式為腫瘤的快速生長(zhǎng)和繁殖提供了大量能量，同時(shí)也創(chuàng)造了特殊的腫瘤微環(huán)境，如pH值降低、活性硫/活性氧（RSS/ROS）含量升高等，該特點(diǎn)為廣譜型腫瘤診斷試劑的開(kāi)發(fā)提供了新思路。然而，由于癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的pH和RSS濃度差異不大，開(kāi)發(fā)能精確區(qū)分這種差異的腫瘤診斷試劑有較大的難度。相反，癌細(xì)胞內(nèi)ROS濃度大約是正常細(xì)胞的10倍，因此，利用該差異理論上可以更加有效地實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的區(qū)分。盡管如此，癌細(xì)胞內(nèi)ROS的含量仍然較低，導(dǎo)致迄今報(bào)道的基于細(xì)胞內(nèi)ROS濃度差異來(lái)區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的熒光診斷試劑對(duì)二者的區(qū)分度并不明顯。

醌氧化還原酶（NQO1）一種同源二聚體黃素酶，在大部分癌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)。在電子供體NAD(P)H存在下，NQO1可以催化醌類(lèi)物質(zhì)發(fā)生單步雙電子還原反應(yīng)生成氫醌，從而促進(jìn)醌的代謝。β-拉帕醌（β-Lap）是一種抗癌藥物，是NQO1的有效底物，能在NQO1的催化下以及NAD(P)H和O₂的參與下發(fā)生氧化還原循環(huán)，快速產(chǎn)生大量的ROS，引起氧化應(yīng)激，最終選擇性殺死癌細(xì)胞（圖1）。由于癌細(xì)胞中NQO1的表達(dá)量遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞（5-200倍），因此用β-Lap處理后的癌細(xì)胞應(yīng)該擁有更高的ROS水平。該特征為高對(duì)比度熒光區(qū)分癌細(xì)胞與正常細(xì)胞奠定了理論基礎(chǔ)。

圖1 診斷原理（A,B）及探針PSiR3與ROS的傳感機(jī)理（C）。

近日，山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院郭煒教授團(tuán)隊(duì)，利用ROS熒光探針PSiR3與β-Lap的組合，分別在活細(xì)胞水平（圖2）和老鼠組織水平（圖3）實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞/正常細(xì)胞以及癌組織/正常組織的高對(duì)比度區(qū)分。癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的平均熒光密度比例為15，癌組織與正常組織的平均熒光密度比例為24，遠(yuǎn)超出了臨床可接受的閾值2.0。這些結(jié)果表明，利用ROS含量不同來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞時(shí)，采用PSiR3/β-Lap組合方式比僅用PSiR3具有更高的對(duì)比度。

圖2 正常細(xì)胞（A）和癌細(xì)胞（B）分別用PSiR3或PSiR3/β-Lap組合方式處理60分鐘后的共聚焦影像結(jié)果及量化的熒光密度（C）。

圖3 老鼠腫瘤組織[（A）A549；（B）HeLa;（C）U89]和正常肌肉組織分別用PSiR3或PSiR3/β-Lap組合處理后的共聚焦影像結(jié)果以及量化的熒光密度（D）。

該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在病人組織切片上驗(yàn)證了上述策略的可行性。如圖4所示，從山西省腫瘤醫(yī)院獲取的病人組織切片分別用PSiR3/β-Lap組合處理60分鐘，其中四個(gè)肺組織樣本和四個(gè)甲狀腺組織樣本在紅色通道顯示了明亮的熒光信號(hào)，表明它們可能是癌組織；其中一個(gè)肺組織樣本和一個(gè)甲狀腺組織樣本在紅色通道顯示了微弱的熒光信號(hào)，表明它們可能是良性組織。這些結(jié)果與臨床蘇木素-伊紅(HE)染色診斷結(jié)果完全一致，證明了該方法的可靠性。

圖4 病人的肺癌組織/良性肺組織（A）和甲狀腺癌組織/良性甲狀腺組織（B）分別用PSiR3或PSiR3/β-Lap組合處理60分鐘后的共聚焦影像結(jié)果。

值得注意的是，利用PSiR3和PSiR3/β-Lap雙重組合方式，該團(tuán)隊(duì)也實(shí)現(xiàn)了腫瘤組織和炎性組織的有效區(qū)分?？偹苤?，炎性細(xì)胞在免疫呼吸爆發(fā)時(shí)會(huì)產(chǎn)生高水平的ROS。然而，作者發(fā)現(xiàn)，與癌細(xì)胞不同的是，炎性細(xì)胞的ROS水平并不能被β-Lap上調(diào)。該發(fā)現(xiàn)為腫瘤組織和炎性組織的區(qū)分提供了契機(jī)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖5），當(dāng)良性組織分別用PSiR3和PSiR3/β-Lap組合處理后，二者均展示出弱熒光信號(hào)；當(dāng)腫瘤組織分別用PSiR3和PSiR3/β-Lap組合處理后，后者的平均熒光密度是前者的15倍；當(dāng)炎性組織分別用PSiR3和PSiR3/β-Lap組合處理后，二者展示了相似的熒光密度。因此，當(dāng)未知的組織樣本分別用PSiR3和PSiR3/β-Lap組合處理后，是否能觀察到一個(gè)顯著的熒光增強(qiáng)是該方法區(qū)分腫瘤組織與炎性組織的重要標(biāo)志。

圖5 老鼠的正常肌肉組織/A549腫瘤組織/發(fā)炎組織（A）和病人的良性子宮組織/肺癌組織/甲狀腺炎組織（B）分別用PSiR3或PSiR3/β-Lap組合方式處理60分鐘后的共聚焦影像結(jié)果。

上述成果近期發(fā)表在國(guó)際化學(xué)頂級(jí)期刊Angewandte Chemie International Edition（Angew. Chem. Int. Ed., 2021, DOI: 10.1002/anie.202102377），文章的第一作者是山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院青年教師劉景，合作作者是山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院青年教師張洪星和碩士研究生劉夢(mèng)星，通訊作者為山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院郭煒教授。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、山西省青年拔尖人才計(jì)劃等項(xiàng)目的資助。

文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202102377

參考資料

[1] 我院郭煒教授團(tuán)隊(duì)在腫瘤診斷研究中取得重要進(jìn)展http://hxx.sxu.edu.cn/zgzj/a6f2cacd78a44141a8e2045d074ea2b8.htm