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2021年7月16日，清華大學(xué)藥學(xué)院胡澤平課題組在《分析化學(xué)》（Analytical Chemistry）期刊在線發(fā)表題為《基于3-硝基苯肼同步衍生化羰基、羧基和磷酸基亞代謝組策略的超靈敏、寬覆蓋LC-MS/MS靶向代謝組學(xué)方法》（Simultaneous 3-Nitrophenylhydrazine Derivatization Strategy of Carbonyl, Carboxyl and Phosphoryl Submetabolome for LC-MS/MS Based Targeted Metabolomics with Improved Sensitivity and Coverage）的文章，通過(guò)采用 3-NPH衍生化策略，建立了基于 LC-MS/MS 的代謝組學(xué)分析方法，該方法同時(shí)靶向含羰基、羧基和磷酸基的代謝物，具有超高的檢測(cè)靈敏度和廣泛的代謝物覆蓋范圍。此外，該方法還可以簡(jiǎn)化細(xì)胞中糖酵解、三羧酸循環(huán)和戊糖磷酸途徑的代謝流分析。代謝是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，代謝異常與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。代謝組學(xué)是闡明代謝調(diào)控和揭示疾病機(jī)制的有力工具，在理解疾病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)治療靶標(biāo)及精準(zhǔn)醫(yī)療中發(fā)揮了重要作用。

盡管近年來(lái)代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)取得了顯著進(jìn)步，但仍然存在許多技術(shù)挑戰(zhàn)需要解決【1-3】。當(dāng)前的代謝組學(xué)方法仍不夠靈敏，對(duì)代謝組的覆蓋度也非常有限，尤其是在分析微量生物樣本時(shí)，例如干細(xì)胞、胚胎發(fā)育樣本等。因此，仍需要進(jìn)一步提高代謝組學(xué)分析方法的靈敏度，以在更少量的生物樣本中檢測(cè)到更多的代謝物。但是，代謝物理化性質(zhì)的多樣性使得開(kāi)發(fā)全面覆蓋整個(gè)代謝組的方法變得非常困難【4,5】。

化學(xué)衍生化是提高代謝物檢測(cè)靈敏度的有效手段【6-8】。然而，一種衍生化試劑通常只能與一種特定的化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)【9,10】，導(dǎo)致目前基于衍生化的代謝組學(xué)分析技術(shù)對(duì)代謝組的覆蓋范圍非常有限。因此，開(kāi)發(fā)一種可以同時(shí)覆蓋多種功能基團(tuán)的衍生化策略將對(duì)代謝組學(xué)分析大有裨益。

圖1.  3-硝基苯肼衍生化策略提高代謝組檢測(cè)靈敏度、拓寬覆蓋度、簡(jiǎn)化代謝流分析

在本研究中，作者采用3-硝基苯肼（3-nitrophenylhydrazine, 3-NPH）作為衍生化試劑，對(duì)羰基代謝物、羧基代謝物和磷酸基代謝物進(jìn)行同步衍生化，從而使用一種衍生試劑同時(shí)衍生化多種類代謝物，極大地提高了單次分析中代謝物的覆蓋度。

該方法共涵蓋了130種代謝物，包括了有機(jī)酸、氨基酸、糖類、核苷酸、肉堿和維生素等。通過(guò)與非衍生化方法的靈敏度進(jìn)行比較，采用該衍生化方法，近 2/3 的代謝物靈敏度達(dá)到了2-300倍的提高。

同時(shí)，衍生化可以將極性代謝物轉(zhuǎn)化為其疏水性衍生物，從而增強(qiáng)代謝物在反相色譜柱上的色譜保留行為，提高了該方法的色譜分離能力，使得多種難以區(qū)分的同分異構(gòu)體通過(guò)該衍生化方法實(shí)現(xiàn)了良好的分離。值得一提的是，本研究首次發(fā)現(xiàn)3-NPH可作為磷酸基代謝物的衍生化試劑，這為該類代謝物的全面分析和拓寬代謝組學(xué)覆蓋度提供了重要工具。

為了考察該方法在少量生物樣品中的適用性，作者將該方法應(yīng)用于 60 個(gè)小鼠卵母細(xì)胞和 5000 個(gè)小鼠造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）的代謝組學(xué)分析。

在60個(gè)卵母細(xì)胞中，該方法檢測(cè)到了72種代謝物，并利用該方法獲得的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)很好地區(qū)分了卵母細(xì)胞兩個(gè)發(fā)育階段（GV期和MII期）之間代謝差異。在5000個(gè)小鼠HSC中，該衍生化方法檢測(cè)到了62種代謝物，比采用非衍生化方法多檢測(cè)到了17種代謝物，這其中包含了葡萄糖-6-磷酸、甘油醛-3-磷酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸等多種具有重要生物學(xué)功能的代謝物。

此外，在該研究中，作者發(fā)現(xiàn)糖酵解、三羧酸循環(huán)和戊糖磷酸途徑中的許多代謝物在衍生化后可產(chǎn)生高強(qiáng)度的來(lái)源于衍生化試劑的質(zhì)譜裂解碎片，采用該裂解碎片進(jìn)行代謝流分析，大大減少了代謝流分析中需要監(jiān)測(cè)的代謝物離子對(duì)的數(shù)量，并且避免了推斷代謝物質(zhì)譜碎裂行為的繁瑣工作，從而簡(jiǎn)化了代謝流分析流程。

圖2.  代謝流分析監(jiān)測(cè)的衍生物碎片離子結(jié)構(gòu)圖

 
綜上，這種基于 3-NPH 衍生化的新方法具有極高的檢測(cè)靈敏度、代謝物覆蓋度和良好的色譜分離度，并且能夠簡(jiǎn)化代謝流分析。該方法有望廣泛應(yīng)用于多種代謝研究，尤其是針對(duì)微量生物樣本的代謝研究。

清華大學(xué)藥學(xué)院博士博士后孟祥駿、龐歡歡為該論文的共同第一作者。清華大學(xué)藥學(xué)院胡澤平研究員為通訊作者。首都醫(yī)科大學(xué)李兵輝教授、清華大學(xué)頡偉、王建偉等教授對(duì)該研究提供了大力支持和幫助。該研究工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委“糖脂代謝的時(shí)空網(wǎng)絡(luò)調(diào)控”重大計(jì)劃的重點(diǎn)項(xiàng)目、科技部“發(fā)育編程及其代謝調(diào)節(jié)”重點(diǎn)專項(xiàng)、清華-北大聯(lián)合生命中心等項(xiàng)目支持。
 
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c00767

 
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