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活體熒光多重成像分析可以對(duì)小動(dòng)物活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行組織、細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究，是輔助科研人員理解疾病發(fā)生機(jī)制、進(jìn)行藥物研發(fā)和臨床精確診斷的重要技術(shù)。然而在實(shí)際應(yīng)用中，該技術(shù)仍面臨著成像深度淺、分辨率差、對(duì)比度低和可檢測通道數(shù)量少等諸多挑戰(zhàn)，其中缺乏光譜分離的近紅外熒光探針是制約該技術(shù)進(jìn)步的重要因素。那么，能否開發(fā)出一套光譜分離的近紅外熒光探針工具，讓科學(xué)家們可以更全面地窺視活體動(dòng)物中的生命活動(dòng)呢？

7月29日，《自然·材料》（Nature Materials）期刊在線發(fā)表了復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系教授張凡團(tuán)隊(duì)的科研成果。這篇以《鉺-細(xì)菌葉綠素雜化近紅外熒光探針用于生物醫(yī)學(xué)多重成像》（“A hybrid erbium (III)-bacteriochlorin near-infrared probe for multiplexed biomedical imaging”）為題的論文，為以上難題的攻克提供了全新的思路與可能。這也是復(fù)旦大學(xué)通過交叉學(xué)科研究取得的又一重要成果。

復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系博士生王婷、博士后王尚風(fēng)共同為第一作者；復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系教授張凡為通訊作者。研究工作得到了復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系、聚合物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、上海市分子催化和功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金委員會(huì)、中國博士后科學(xué)基金會(huì)、上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)等機(jī)構(gòu)與項(xiàng)目的大力支持。

技術(shù)進(jìn)步：近紅外熒光成像逐步應(yīng)用于活體多重檢測分析

熒光是自然界中的一種光致發(fā)光現(xiàn)象。因其靈敏度高，分辨率好且具有實(shí)時(shí)性等特點(diǎn)，熒光成像在生命科學(xué)、藥學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域都有著非常廣闊的應(yīng)用前景。借助于多種熒光探針的標(biāo)記，人們還能同時(shí)通過多個(gè)不同波長的信號(hào)組合，實(shí)現(xiàn)多個(gè)待測物的同時(shí)多通道檢測。

過去，體外診斷或者細(xì)胞成像是研究者們的主要目的，因而傳統(tǒng)的可見光（波長400~700 nm）區(qū)熒光探針即可滿足要求。隨著科學(xué)研究的不斷深入，人們越來越需要理解活體動(dòng)物原位微環(huán)境的生物學(xué)機(jī)制，但由于生物體內(nèi)不同的組織（如皮膚、脂肪、骨骼等）對(duì)激發(fā)光和發(fā)射光均具有不同程度的散射和吸收作用，使得在這個(gè)區(qū)間內(nèi)的光學(xué)穿透深度和成像分辨率都不理想。這種現(xiàn)象就好比是在大霧天看風(fēng)景，不僅看不清也看不遠(yuǎn)。

近紅外（波長700~1700 nm）窗口逐漸被證實(shí)是一個(gè)生物組織的光學(xué)“透明”窗口。近紅外光在穿透皮膚、脂肪和骨骼等生物組織時(shí)發(fā)生的散射和吸收現(xiàn)象均較少，因而相對(duì)于可見光而言其“折損率”更低。不僅如此，在近紅外區(qū)域，來自于生物體內(nèi)各種色素的自發(fā)熒光也極大的降低。在這兩大優(yōu)勢的助力下，近紅外區(qū)域內(nèi)的熒光成像在活體動(dòng)物研究中有著較好的表現(xiàn)與巨大的發(fā)展前景。

然而在實(shí)際應(yīng)用中，近紅外活體熒光多重成像仍舊不理想，其潛力還未得到完全釋放。當(dāng)前使用的熒光探針普遍光譜較寬，吸收發(fā)射挨的近，因而無法對(duì)生物組織進(jìn)行無串?dāng)_的多重標(biāo)記與成像。

研究突破：構(gòu)建光譜分離的近紅外熒光探針實(shí)現(xiàn)高對(duì)比度的活體多重成像

針對(duì)以上難題，張凡團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于稀土鉺離子與細(xì)菌葉綠素配位的新型近紅外熒光探針體系，實(shí)現(xiàn)了光譜分離的活體熒光多重成像。稀土鉺離子配合物具有1530 nm左右的特征單色發(fā)光特性，理論上非常適合用來進(jìn)行活體熒光成像研究。然而要在生理環(huán)境下實(shí)現(xiàn)這一發(fā)光卻并不容易。傳統(tǒng)的分子構(gòu)建策略不僅容易導(dǎo)致鉺離子的發(fā)光被水分子淬滅，而且分子的激發(fā)波長常常在紫外光區(qū)，無法在活體成像中進(jìn)行應(yīng)用。研究人員發(fā)現(xiàn)自然界中的紫細(xì)菌能夠利用細(xì)菌葉綠素高效地捕捉近紅外光并將光能轉(zhuǎn)換為化學(xué)能。

受此啟發(fā)，張凡團(tuán)隊(duì)提出了以細(xì)菌葉綠素作為天線配體敏化稀土鉺離子的新穎策略，所構(gòu)造出的熒光探針不僅能在水相中發(fā)射出明亮的近紅外熒光，而且其吸收和發(fā)射半峰寬小于32 nm，斯托克斯位移值達(dá)到了760 nm，為活體熒光多重成像的實(shí)現(xiàn)提供了強(qiáng)有力的研究工具。

團(tuán)隊(duì)利用超快光譜技術(shù)和低溫磷光光譜分析揭示了細(xì)菌葉綠素和鉺離子之間存在高效的三重態(tài)能量轉(zhuǎn)移過程，并且進(jìn)一步通過分子工程調(diào)控了配體的吸收，驗(yàn)證了圍繞鉺-細(xì)菌葉綠素體系開發(fā)多色可調(diào)近紅外熒光探針工具的可行性。

圖1：（a）鉺-細(xì)菌葉綠素配合物的能量傳遞機(jī)理圖；（b）鉺-細(xì)菌葉綠素配合物的代表性分子EB766的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；（c）EB766的單晶結(jié)構(gòu)；（d）EB766的吸收和發(fā)射光譜圖；（e）超快瞬態(tài)吸收光譜表征EB766的激發(fā)態(tài)動(dòng)力學(xué)過程。

圖2：（a-c）基于新型近紅外熒光探針構(gòu)建的激發(fā)光譜分離多重成像方案，

實(shí)現(xiàn)了小鼠血管和淋巴管結(jié)構(gòu)的高分辨率成像；

（d-g）基于新型近紅外熒光探針構(gòu)建的發(fā)射光譜分離多重成像方案，

實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞在小鼠腦部轉(zhuǎn)移的動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)可視化觀察。

最后，張凡團(tuán)隊(duì)基于探針優(yōu)異的光學(xué)特性和生物相容性進(jìn)行了生物成像研究。探針較窄的吸收光譜特性使得通過正交激發(fā)控制的多重成像方法可以清晰地勾勒出小鼠血管和淋巴管的精細(xì)結(jié)構(gòu)及其空間位置關(guān)系，并能實(shí)時(shí)顯現(xiàn)胃腸道消化系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)的代謝活動(dòng)。該方法有望為手術(shù)導(dǎo)航和臨床診斷提供更精準(zhǔn)的信息。團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用新型探針標(biāo)記了小鼠體內(nèi)的癌細(xì)胞，探針較窄的發(fā)射光譜特性也讓正交發(fā)射控制的多重成像方法得以在小鼠腦部以無創(chuàng)傷的方式清晰地觀察到癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、遷移、以及在血管壁上駐扎等過程。相比于原先的研究方法，這種方法有效地避免了開視窗造成的組織損傷，以及昂貴的成像設(shè)施，為活體水平的細(xì)胞互作研究提供了新的研究平臺(tái)。

該研究目前已經(jīng)取得了較好的初步應(yīng)用效果，未來還需要更進(jìn)一步地提高探針的發(fā)光效率，增加顏色通道以更好的滿足活體內(nèi)高通量多重檢測的應(yīng)用需求。此外，改善探針分子的功能修飾特性，增強(qiáng)與前沿生物與成像技術(shù)的兼容性等問題仍然有待后續(xù)研究。但這一科研成果所點(diǎn)亮的諸多可能，都將為化學(xué)與材料科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)、生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程和醫(yī)療診斷等領(lǐng)域拓寬研究視野與前行的方向。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41563-021-01063-7