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酰胺鍵是一種廣泛存在于自然界的基本官能團。據(jù)統(tǒng)計，約四分之一的上市藥物與三分之二的候選藥物含有酰胺鍵。酰胺鍵的形成是藥物合成化學中應用最廣泛的有機化學反應。因此，酰胺鍵的形成成為科學家廣泛關注的一個研究領域。經(jīng)過一個多世紀的發(fā)展，已經(jīng)有近百種酰胺鍵形成方法被發(fā)展出來。但是，由于這些方法的手性原料難以獲得，因此其能夠用于合成α-手性酰胺的方法非常有限，能夠用于多肽合成的方法則更少。目前應用最廣泛、最可靠的多肽合成方法還是天然α-氨基酸在縮合劑作用下脫水縮合。但是傳統(tǒng)縮合劑在用于肽鍵的構(gòu)建時，由于其對α-氨基酸羧基的過度活化而經(jīng)常會誘發(fā)α-位手性中心的外消旋化和其它副反應。另外，雖然多肽合成已實現(xiàn)了自動化，但其原子經(jīng)濟性極差，導致產(chǎn)生大量化學廢物、多肽生產(chǎn)成本高昂等問題。但固相多肽合成已經(jīng)達到了其技術瓶頸，只能通過原始創(chuàng)新的肽鍵形成方法才有望解決多肽合成中的這些問題。因此，隨著多肽在藥物、材料、化妝品等精細化學品中日益重要的應用，綠色高效的多肽合成方法逐漸成為該領域亟待解決的關鍵科學問題。

趙軍鋒課題組致力于通過發(fā)展有機化學新試劑和新反應來解決多肽與蛋白質(zhì)化學合成與修飾中的關鍵科學問題。2016年，他們首次發(fā)現(xiàn)炔酰胺可以用作不消旋的多肽縮合劑（J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 13135），利用炔酰胺類縮合劑他們還發(fā)展了一種在多肽主鏈骨架上精準引入硫代酰胺鍵的方法（Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 1382，J. Org. Chem., 2020, 85, 1484.）。同時他們還發(fā)現(xiàn)炔酰胺類縮合劑還能夠用于分子間酯化反應（J. Org. Chem., 2020, 85, 6188）與大環(huán)內(nèi)酯化反應（ACS Catal., 2020, 10, 5230.）中，表明炔酰胺是一類廣譜高效的縮合試劑。最近，他們在不消旋構(gòu)建酰胺鍵領域又取得新進展，他們發(fā)現(xiàn)聯(lián)烯酮也可以作為縮合劑用于酰胺鍵的不消旋構(gòu)建，并成功將該方法用于多肽合成。

通過對以往縮合試劑分子結(jié)構(gòu)的認真分析，作者發(fā)現(xiàn)它們有一個共同的特點就是這些分子都含有一個sp雜化中心碳原子（圖1）。因此，作者提出了從同樣含有sp雜化中心碳原子的聯(lián)烯衍生物中開發(fā)縮合劑的想法。由于聯(lián)烯衍生物與羧酸反應生成的烯基酯中間體不含有堿性基團，有望避免其它含堿性基團的縮合劑造成的α-碳手性中心外消旋化的風險。經(jīng)過初步的研究，作者發(fā)現(xiàn)聯(lián)烯酮有望作為潛在的聯(lián)烯衍生物縮合試劑。接下來，作者對聯(lián)烯酮介導的酰胺鍵形成反應進行了系統(tǒng)深入的研究。他們發(fā)現(xiàn)室溫條件下苯基聯(lián)烯酮2a與苯甲酸即可進行反應并以95%的收率生成α-羰基烯基酯3a（圖2式1）。而α-羰基烯基酯3a能在室溫DMF中與2-苯乙胺快速發(fā)生氨解反應，以幾乎定量的收率得到酰胺4a（圖2式2）。這兩步反應均可自發(fā)進行，反應過程中不需要任何額外的添加劑或催化劑（圖2）。值得注意的是上世紀60年代科學家曾提出烯基酯不適合于酰胺和多肽合成，這是因為烯基酯的羰基副產(chǎn)物會與氨基組分的氨基發(fā)生直接脫水生成亞胺。幸運的是，本文中的亞胺副反應速度非常慢，不會對主產(chǎn)物的收率造成影響（圖2式3）。

在獲得了最優(yōu)的反應體系后，作者首先對聯(lián)烯酮介導的酰胺形成反應進行了底物拓展。如圖3所示，各類烷基、芳基和α,β-不飽和羧酸都能與聯(lián)烯酮2a發(fā)生1,4-加成/異構(gòu)化反應，以近乎定量的收率獲得相應的α-羰基烯基酯。由于其收率和純度都很高，因此該活性中間體可不經(jīng)純化直接用于氨解反應，實現(xiàn)了“兩步一鍋”法合成酰胺。對于那些位阻大的底物以及親核性弱的胺，該策略也能很好的兼容，以優(yōu)秀的收率獲得相應產(chǎn)物。作者還發(fā)現(xiàn)10%的HOBt催化劑可顯著提高那些困難底物的反應速率（圖3）。

初步證明了聯(lián)烯酮是一類有效的酰胺縮合劑后，作者嘗試將該策略用于更具挑戰(zhàn)性的肽鍵的構(gòu)建。作者先考察了N-保護α-氨基酸與聯(lián)烯酮縮合劑的反應效率，如圖4所示，20種天然α-氨基酸和各種非天然氨基酸都可與聯(lián)烯酮2a進行高效的1,4-加成/異構(gòu)化反應（活化過程）。除了組氨酸以外，都能以定量的收率獲得相應的α-羰基烯基酯。大位阻的氨基酸也能夠很好的反應，同時羥基、伯酰胺、色胺等活潑側(cè)鏈官能團和Fmoc、Cbz、Boc等保護基都可兼容。這些氨基酸的活化酯都是穩(wěn)定的固體，易于純化和保存。然后作者考察了這些氨基酸活化酯在二肽合成中的應用，他們發(fā)現(xiàn)天然氨基酸的α-羰基烯基酯都可以順利地與α-氨基酸酯進行氨解反應，在室溫下以幾乎定量的收率生成相應的二肽。大位阻的天然與非天然氨基酸都可以作為羧酸組分或氨基組分參與反應。當大位阻氨基酸作為羧酸組分時，需要稍長時間才能完成反應，加入10%的HOBt催化劑可大大加快反應的進行。值得說明的是，對于20種天然氨基酸，無論是在活化過程還是后續(xù)的氨解反應，都不會發(fā)生外消旋化或者差向異構(gòu)化。即使對于最容易發(fā)生消旋的苯甘氨酸，也可以很好地作為酸或者胺參與反應。雖然苯甘氨酸作為酸組分在室溫氨解時觀察到少量的消旋，但低溫下反應則可完全避免消旋。該策略用于氨解反應時，對各種側(cè)鏈官能團也都有非常好的兼容性。無論是絲氨酸、蘇氨酸側(cè)鏈的羥基，還是天冬酰胺、谷氨酰胺側(cè)鏈的伯酰胺，還有色氨酸側(cè)鏈的色胺基團，都不影響肽鍵的形成（圖4）。與普通酰胺一樣，由于氨基酸活化過程的高效性，其活化酯無需純化即可用于下一步氨解反應，因此所有二肽都可以通過“兩步一鍋”法進行合成，反應效果甚至優(yōu)于兩步法。值得一提的是，在二肽的合成過程中，僅需要1.1倍當量的氨組分即可高效完成反應。

為了進一步探索聯(lián)烯酮類縮合試劑的應用范圍，作者嘗試將其用于多肽片段連接。與脲烷型保護基如Fmoc、Boc、Cbz等保護的單個氨基酸相比，多肽片段羧酸在活化與氨解時更易發(fā)生消旋（差向異構(gòu)化）。如圖5所示，聯(lián)烯酮2a作為縮合試劑可順利地與二肽、三肽和四肽羧酸發(fā)生1,4-加成/異構(gòu)化反應（活化），以優(yōu)秀的收率生成相應的多肽α-羰基烯基酯。這些多肽活化酯能夠與另外的氨基酸酯或者多肽片段發(fā)生氨解反應實現(xiàn)多肽片段連接，以優(yōu)異的收率獲得相應的多肽產(chǎn)物。讓作者欣慰的是，與二肽的合成類似，不論在多肽片段羧酸活化過程還是后續(xù)的氨解反應中，都無外消旋化（差向異構(gòu)化）副反應發(fā)生。雖然肽鏈增長之后活化所需時間較長，但是其氨解反應仍然非常迅速，通常幾分鐘到幾小時即可完成。在多肽片段連接中，僅需1.1倍當量的氨組分多肽即可高效完成反應，連接位點并不局限于某些特定氨基酸。該策略操作簡單，原子經(jīng)濟性高，連接位點廣譜且不發(fā)生差向異構(gòu)化，為長鏈多肽藥物的合成提供了一種極富吸引力的匯聚式合成方法（圖5）。

聯(lián)烯酮類縮合劑的優(yōu)勢在多肽藥物卡非佐米的化學全合成中表現(xiàn)的淋漓盡致?？ǚ亲裘资敲绹鳩DA于2012年批準的一款治療多發(fā)性骨髓瘤的特效多肽藥物，其2020年全球銷售額為16.5億美元。該多肽藥物中C端的環(huán)氧基團在常規(guī)的多肽合成條件下（氨基酸縮合與脫保護）都不穩(wěn)定，該片段必須要在合成的后期引入，因此傳統(tǒng)的C端向N端多肽合成方法不利于該藥物的合成。相反，沿N端向C端的反向肽鏈延伸方式是解決卡非佐米合成問題的理想策略。但是該策略涉及到多肽羧酸的反復活化與縮合，常規(guī)縮合劑都會誘發(fā)比較嚴重的消旋，不但增加了純化的難度，而且降低了目標產(chǎn)物的收率，因此文獻報道總收率都非常低（26-36%）。作者發(fā)現(xiàn)聯(lián)烯酮2a是合成卡非佐米的理想縮合劑，通過聯(lián)烯酮介導的肽鍵形成方法，作者成功實現(xiàn)了從N端到C端的卡菲佐米全合成。由于肽鍵形成過程中避免了消旋副反應的發(fā)生，不但純化方便，而且主產(chǎn)物收率得到了提高，因此總產(chǎn)率（68%）相較于傳統(tǒng)方法（26-38%）得到了極大的提升（圖6）。

在固相多肽合成技術發(fā)明之前，活化酯氨解策略一直是合成多肽的有效方法?；罨サ慕Y(jié)構(gòu)明確、活性適中、反應機理簡單，能夠有效避免外消旋化與其它副反應的發(fā)生，但不足之處是氨解反應時間太長（幾天到兩周）。另外，活化酯需要預先合成，大多都需要用到化學計量的縮合試劑、羥基親核試劑乃至消旋抑制劑。在操作與原子經(jīng)濟性層面上與縮合劑法相比并無優(yōu)勢，因此隨著縮合試劑與固相多肽合成的發(fā)展，活化酯法逐步淡出了多肽合成領域。如果能夠解決活化酯的低活性和難合成的問題，活化酯法將有望解決當前縮合劑法在固相多肽合成中的消旋與其它副反應的問題。與傳統(tǒng)活化酯相比，聯(lián)烯酮與氨基酸形成的活化酯具有易合成、活性高、原子經(jīng)濟性好和反應條件溫和等優(yōu)點，同時肽鍵形成過程中不會發(fā)生外消旋化。因此，聯(lián)烯酮活化酯法兼具了傳統(tǒng)活化酯法與縮合劑法的優(yōu)點而避免了其缺點，有望用于固相多肽合成。為了考察α-羰基烯基酯在固相多肽合成中應用的可行性，作者選取經(jīng)典困難十肽ACP(65-74)為模型。作者發(fā)現(xiàn)在固相載體上僅需兩倍當量的α-羰基烯基酯即可定量不消旋地完成肽鍵的構(gòu)建，無需外加消旋抑制劑和堿性添加劑，反應一般在1-2小時完成。外加10%的HOBt催化劑可顯著提高反應速率，使大部分氨基酸的縮合反應在20-30分鐘內(nèi)即可完成，而大位阻氨基酸也能在2小時內(nèi)完成縮合。作者通過反復的9次縮合與脫保護循環(huán)，最終獲得了純度為98%的困難十肽ACP(65-74)粗產(chǎn)物。作者同時也與經(jīng)典固相多肽合成方法進行了對比，當用PyBOP與HBTU作為縮合劑時，分別獲得了86%和77%粗肽產(chǎn)物。而當以氨基酸的五氟苯酚酯為活化酯時，粗肽純度僅為60%。與傳統(tǒng)固相多肽合成方法相比，聯(lián)烯酮活化酯法展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)越性。另外，作者還發(fā)現(xiàn)氨基酸的α-羰基烯基酯的DMF溶液在室溫下可以保存十天而不變質(zhì)，因此該方法有望用于多肽的自動合成。

趙軍鋒教授課題組發(fā)展了一種聯(lián)烯酮介導的不消旋酰胺鍵形成方法，并成功將該方法用于多肽合成。該策略無需額外的催化劑和添加劑即可在溫和的條件下高效完成氨基酸的活化及活性中間體的氨解，以幾乎定量的收率獲得目標酰胺。由于反應過程中不會發(fā)生外消旋化或差向異構(gòu)化，因此該方法不僅可以用于普通酰胺及二肽的合成，也可用于多肽片段連接及多肽固相合成，對于20種天然α-氨基酸及其它非天然氨基酸都有很好的適應性。氨基保護的α-氨基酸在室溫敞口容器中即可自發(fā)與聯(lián)烯酮發(fā)生加成反應定量生成α-羰基烯基酯中間體，此類烯基活化酯制備簡捷、高效，且無需額外的羥基親核試劑。20種天然氨基酸的活化酯都是穩(wěn)定的固體，可在冰箱中存放12個月以上不變質(zhì)?；罨ズ罄m(xù)的氨解反應也是在室溫敞口容器中進行，無需其它添加劑，反應迅速（大部分酰胺可在1小時內(nèi)完成）。烯基酯優(yōu)良的反應活性不但避免了外消旋化的發(fā)生，而且降低了其它副反應發(fā)生的風險。因此該策略整合了傳統(tǒng)縮合試劑的高活性及活化酯策略不消旋的優(yōu)點，并且克服了二者的缺點。聯(lián)烯酮縮合劑的成功開發(fā)為多肽縮合試劑的設計提供了新思路，開辟了多肽合成新途徑。該工作不但具有重要的學術價值，而且具有廣闊的應用前景。

由于20種天然氨基酸的活化酯易于合成，且都為穩(wěn)定的固體，易于純化和保存，都可直接用于固相多肽合成。與傳統(tǒng)固相多肽合成每步縮合需要氨基酸、縮合劑、消旋抑制劑和堿性添加劑等四種試劑相比，該方法只需要活化酯一種試劑即可（10%的HOBt可顯著縮短反應時間），極大地簡化了固相多肽合成的試劑配方，展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)越性。作者正在推動20種天然氨基酸α-羰基烯基酯的商業(yè)化，這樣用戶可直接采購氨基酸的活化酯進行多肽合成。簡化的試劑配方使多肽合成更加便捷，同時大幅度減少了肽鍵形成時化學廢物的產(chǎn)生，實現(xiàn)了節(jié)能減排，降低了多肽的生產(chǎn)成本。因此，聯(lián)烯酮介導的不消旋肽鍵形成策略將有望成為多肽合成工業(yè)的一項變革性技術。

相關研究工作發(fā)表在J. Am. Chem. Soc.上，該工作得到了國家自然科學基金重大研究計劃、面上項目和南開大學元素有機化學國家重點實驗室開放基金的支持。