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分子水平的蛋白質(zhì)識(shí)別在疾病的早期診斷和治療中具有重要的意義。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)可以通過(guò)質(zhì)譜和免疫分析等手段進(jìn)行鑒定。隨著研究的深入，人們對(duì)蛋白質(zhì)的分析已從對(duì)一級(jí)序列的研究延伸到通過(guò)觀測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化來(lái)理解蛋白質(zhì)的功能。然而，低豐度的蛋白質(zhì)病理變化很可能被宏觀手段所獲得蛋白質(zhì)集成信息所掩蓋，無(wú)法捕捉到單個(gè)蛋白質(zhì)的異常結(jié)構(gòu)特征。目前開(kāi)發(fā)一種能夠識(shí)別不同的蛋白質(zhì)，并區(qū)分由配體/藥物結(jié)合和融合等過(guò)程引起的單個(gè)蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，仍然是基礎(chǔ)研究中的一個(gè)挑戰(zhàn)。

納米孔作為一種單分子蛋白質(zhì)傳感手段的優(yōu)勢(shì)正在逐漸顯現(xiàn)。許多工作已經(jīng)證明納米孔能夠以單分子分辨率對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別和結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)直接分析。然而蛋白質(zhì)與核酸不同，其表面電荷分布和整體帶電性質(zhì)差異較大，難以在統(tǒng)一的測(cè)試環(huán)境下都獲得足夠的捕獲效率，這使得同時(shí)感知不同電荷蛋白質(zhì)的傳感器設(shè)計(jì)變得復(fù)雜。近年來(lái)，研究者通過(guò)工程化改造納米孔內(nèi)電荷分布的策略增加電滲透（EOF）作用，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一系列適合蛋白質(zhì)分析的生物納米孔道例如溶細(xì)胞素A（ClyA），曲霉毒素C（FraC）和胸膜溶素AB（PlyAB）。但這種策略可能影響待測(cè)蛋白和納米孔的形狀和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，影響分析效率。同時(shí)，以上傳感系統(tǒng)均暫未實(shí)現(xiàn)生物樣品的直接檢測(cè)。 

圖1. 機(jī)器學(xué)習(xí)輔助MspA納米勢(shì)阱同時(shí)檢測(cè)不同電荷蛋白質(zhì)

最近，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院黃碩教授課題組提出了一種簡(jiǎn)單有效的方案，將KCl/CaCl₂不對(duì)稱(chēng)電解質(zhì)緩沖液與恥垢分枝桿菌孔蛋白A (MspA) 檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合構(gòu)建電滲透(EOF)納米勢(shì)阱。這種方法可以將納米孔對(duì)蛋白質(zhì)的捕獲效率提高7~18倍，且分析時(shí)間延長(zhǎng)達(dá)159倍，極大程度提高了納米孔解析蛋白質(zhì)的能力。使用這種MspA勢(shì)阱，天然肌紅蛋白（holo-MB）和其脫輔基狀態(tài)(apo-MB)之間的結(jié)構(gòu)差異可以被清晰的分辨；另外，兩種天然無(wú)序蛋白（ATCR和NCBD）形成復(fù)合物前后的結(jié)構(gòu)差異也可以在單分子尺度被清晰的表征。更重要的是，堿性的溶菌酶(pI=11)、中性的apo/holo-肌紅蛋白（pI=8.5 和7.3）和酸性的ACTR/NCBD復(fù)合物（pI=5.75）可在pH=7.0的測(cè)試環(huán)境下被同時(shí)傳感。這是納米孔分析策略中首次實(shí)現(xiàn)不同電荷性質(zhì)的蛋白質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。

圖2. MspA納米勢(shì)阱鑒別乳清蛋白粉中的ɑ-乳白蛋白和β-乳球蛋白

進(jìn)一步，為了實(shí)現(xiàn)混合傳感事件分類(lèi)的自動(dòng)化，作者提取了蛋白質(zhì)對(duì)離子流阻塞的七個(gè)特征構(gòu)建了機(jī)器學(xué)習(xí)分類(lèi)模型，對(duì)不同蛋白質(zhì)的鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)到99.9%。這種機(jī)器學(xué)習(xí)輔助的MspA納米勢(shì)阱可以被用于直接從市售乳清蛋白粉中快速鑒定并定量其中的ɑ-乳白蛋白和β-乳球蛋白，無(wú)需對(duì)樣品做任何的純化預(yù)處理步驟，樣品濃度0.4 μg/mL即可測(cè)試。驗(yàn)證了該策略在從混合物中蛋白質(zhì)標(biāo)記物的快速、高靈敏度檢測(cè)和實(shí)時(shí)結(jié)構(gòu)分析方面的具有非常好的應(yīng)用前景，為納米孔的蛋白質(zhì)無(wú)標(biāo)簽直接分析提供了新的思路。

該工作以“Machine Learning Assisted Simultaneous Structural Profiling of Differently Charged Proteins in a Mycobacterium smegmatis Porin A (MspA) Electroosmotic Trap”為題，于2022年1月7日發(fā)表于《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)期刊》（文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c09259，DOI：https://doi.org/10.1021/jacs.1c09259）南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院博士生劉瑤為該論文的第一作者，黃碩教授為論文通訊作者，陳洪淵院士對(duì)該工作做出了重要指導(dǎo)。此項(xiàng)研究得到了生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院(ChemBIC)的重要支持，國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：31972917, 91753108, 21675083）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：020514380257, 020514380261)、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進(jìn)計(jì)劃（個(gè)人、團(tuán)體計(jì)劃）、江蘇省自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：BK20200009）、南京大學(xué)生命科學(xué)分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(項(xiàng)目編號(hào)：5431ZZXM1902)、南京大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目、中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2021M691508)等提供了經(jīng)費(fèi)支持。

參考資料：https://chem.nju.edu.cn/88/20/c12639a559136/page.htm