1、什么是高通量篩選技術(shù)?
高通量篩選(High- throughput screening, ,HTS)是指以分子或和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ),采用不同密度的微孔平板作為實(shí)驗(yàn)載體和自動(dòng)化工具操作實(shí)驗(yàn)步驟,通過快速靈敏的檢測(cè)裝置在同一時(shí)間內(nèi)對(duì)海量樣品進(jìn)行生物活性測(cè)定、采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和數(shù)字化分析處理,并以相應(yīng)的信息管理軟件支持整個(gè)系統(tǒng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。
2、傳統(tǒng)的藥物篩選模式是怎樣的?
傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)模式是在確定藥物作用靶點(diǎn)及其功能和/或結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,采用各種實(shí)驗(yàn)手段,通過體內(nèi)外多種模型對(duì)樣品進(jìn)行篩選,評(píng)價(jià)其生物活性和藥理特征。根據(jù)活性分子的特點(diǎn),進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)的優(yōu)化改造,經(jīng)動(dòng)物毒理和藥代動(dòng)力學(xué)分析研究后確定藥物先導(dǎo)化合物,進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)。這種方法一般需要消耗大量的樣品和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,對(duì)技術(shù)人員的操作技能有較高要求,難以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)一定數(shù)量的樣品開展有效和經(jīng)濟(jì)的篩選。隨著各類化合物樣品庫儲(chǔ)量的不斷增加以及組合化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,采用傳統(tǒng)手段篩選海量樣品不僅不可能而且極大地限制了新藥研究之進(jìn)程。
3、高通量篩選技術(shù)與傳統(tǒng)的藥物篩選方法相比有什么優(yōu)勢(shì)和局限?
高通量藥物篩選在傳統(tǒng)篩選手段的基礎(chǔ)上,綜合應(yīng)用多種先進(jìn)的技術(shù)成果和制造工藝,使藥物發(fā)現(xiàn)的方式方法和理論模式產(chǎn)生了巨大的變化。高通量藥物篩選技術(shù)以藥物與靶分子或靶細(xì)胞之間的作用機(jī)理為依據(jù)進(jìn)行生物活性分析,通過整合計(jì)算機(jī)控制、自動(dòng)化操作、平行多道檢測(cè)和數(shù)據(jù)采集處理等各個(gè)步驟,達(dá)到微量、快速、靈敏、準(zhǔn)確的目標(biāo),是當(dāng)代新藥發(fā)現(xiàn)技術(shù)的重大進(jìn)步,為全球各大醫(yī)藥公司和著名研究機(jī)構(gòu)所廣泛使用。
與傳統(tǒng)的藥物篩選方法相比,高通量篩選技術(shù)具有反應(yīng)體積小,自動(dòng)化,靈敏快速檢測(cè),高度特異性等優(yōu)點(diǎn)。但是,高通量篩選作為藥物篩選的方法,并不是一種萬能的手段,特別是在中藥研究方面,其局限性也是十分明顯的。
首先,高通量篩選所采用的主要是分子、細(xì)胞水平的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,因此任何模型都不可能充分反映藥物的全面藥理作用?/span>
其次,用于高通量篩選的模型是有限的和不斷發(fā)展的,要建立反映機(jī)體全部生理機(jī)能或藥物對(duì)整個(gè)機(jī)體作用的理想模型,也是不現(xiàn)實(shí)的。但我們應(yīng)該相信,隨著對(duì)高通量篩選研究的不斷深入,隨著對(duì)篩選模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、新的藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)以及篩選模型的新穎性和實(shí)用性的統(tǒng)一,高通量篩選技術(shù)必將在未來的藥物研究中發(fā)揮越來越重要的作用。
4、高通量篩選由那幾部分組成?
高通量篩選由五個(gè)技術(shù)元件組成:
(1)化合物樣品庫
擁有足夠數(shù)量和結(jié)構(gòu)各異的化合物樣品是實(shí)施高通量藥物篩選的基本條件之一?;衔飿悠穾焓怯芍T多具有不同屬性的有機(jī)化合物所組成的,包括人工合成、天然產(chǎn)物和微生物次生代謝物等多種來源。
(2)特異性體外篩選模型
高通量篩選不僅要求微升級(jí)的反應(yīng)體積,而且要求這種反應(yīng)具有靶點(diǎn)特異性和檢測(cè)敏感性,由此建立的篩選模型呈現(xiàn)出很高的技術(shù)含量。
(3)自動(dòng)化操作系統(tǒng)
利用計(jì)算機(jī)通過操作軟件控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。操作軟件采用實(shí)物圖像代表實(shí)驗(yàn)用具,簡(jiǎn)潔明了地以圖示體現(xiàn)機(jī)器的動(dòng)作。自動(dòng)化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組分,根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫孵和離心等設(shè)備以進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)步驟。
(4)高靈敏的檢測(cè)儀器
檢測(cè)儀器一般包括液閃計(jì)數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器、寬譜帶分光光度儀和熒光光度儀等。
(5)數(shù)據(jù)處理管理系統(tǒng)
數(shù)據(jù)處理管理系統(tǒng)主要承擔(dān)著化合物樣品及其生物活性信息的收集、存儲(chǔ)、分析、處理、整合和演繹的功能,為提供高通量藥物篩選服務(wù)和藥物發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)研究提供支撐。
5、化合物樣品庫是怎么建立的?
高通量篩選是一種利用已有的化合物進(jìn)行的體外隨機(jī)篩選。因此,通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)的苗頭化合物(Hit compounds)其有效性取決于被篩樣品庫的規(guī)模和質(zhì)量。擁有足夠數(shù)量和結(jié)構(gòu)各異的化合物樣品是實(shí)施高通量藥物篩選的基本條件之一?;衔锏馁|(zhì)量主要表現(xiàn)在樣品來源、組成種類、類藥性、理化特性和純度等方面。許多活性反應(yīng)基團(tuán)(Reactive groups)會(huì)使初篩的假陽性率大幅上升,將其剔除可以提高化合物樣品庫的質(zhì)量。
化合物樣品庫是由諸多具有不同屬性的有機(jī)化合物所組成的,包括人工合成、天然產(chǎn)物和微生物次生代謝物等多種來源。
(1)人工合成又可分為常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。采用常規(guī)化學(xué)合成的純化合物一直是國(guó)外制藥企業(yè)化合物庫樣品的主要來源。它們通過長(zhǎng)年累積的化合物建立樣品庫,通過購(gòu)買和化合物交流使樣品庫的數(shù)量和質(zhì)量不斷提高。
組合化學(xué)(Combinatorial chemistry)的出現(xiàn)為大量增加化合物的數(shù)量提供一條有效途徑。組合化學(xué)所要解決的根本問題是怎樣快速地得到大量結(jié)構(gòu)多樣、覆蓋面廣的化合物樣品。它要求組合有限的幾種化學(xué)試劑以獲得盡可能多的產(chǎn)物。因此,同一組試劑應(yīng)具有相同的反應(yīng)基團(tuán),彼此之間的差別僅在于不參與合成反應(yīng)的其他基團(tuán)的不同。一步反應(yīng)所得到的多種產(chǎn)物,實(shí)質(zhì)上是同一類型結(jié)構(gòu)略異的相似物;多步反應(yīng)所得到的產(chǎn)物依然是同類型的,只是部分分子結(jié)構(gòu)更多樣、更復(fù)雜而已。然而,當(dāng)不同的共性反應(yīng)不是按先后順序而是平行獨(dú)立進(jìn)行時(shí),就能夠獲得類型不同、結(jié)構(gòu)各異的多種產(chǎn)物。
目前常用的組合化學(xué)合成方法包括固相和液相兩大類。固相合成即先把反應(yīng)物連接到一個(gè)固相載體(通常是官能團(tuán)化的高分子材料)上,然后在非均相的條件下進(jìn)行有機(jī)反應(yīng),被廣泛應(yīng)用于大數(shù)目樣品庫的合成。液相合成采用一步多組分或一鍋多步反應(yīng)的經(jīng)典技術(shù),包括多組分合成法和官能團(tuán)轉(zhuǎn)換法,核心問題在于反應(yīng)產(chǎn)物的高效分離提純。多組分反應(yīng)速度快、易操作,適用于合成數(shù)量大和多樣化的化合物樣品庫。官能團(tuán)轉(zhuǎn)化法靈活方便,尤宜于數(shù)目較小的系列化合物樣品庫的制備,常用來進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改造和構(gòu)效關(guān)系研究。
(2)從天然產(chǎn)物里分離獲得的單體化合物,其母核結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)是通過長(zhǎng)期的自然選擇而形成的,在篩選過程中所表現(xiàn)出來的生物活性具有人工合成化合物所無法比擬的優(yōu)勢(shì)。因此,結(jié)構(gòu)多樣的天然產(chǎn)物及其衍生物在創(chuàng)新藥物的研究中具有極其重要的地位。長(zhǎng)期以來,天然藥物研究所采取的技術(shù)路線主要是以體內(nèi)外藥理活性跟蹤檢測(cè)為基礎(chǔ),從來源于陸地或海洋的動(dòng)植物和微生物中提取、分離和鑒定有效成分,必要時(shí)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改造,最終確定藥物先導(dǎo)化合物。在一般情況下,通過全合成、半合成或直接提取的方式能夠解決原料之來源。為了加快新藥發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程和提高研究效率,近年來科研人員創(chuàng)建了一系列新技術(shù)、新方法和新手段,如自動(dòng)化平行和序列組合高通量制備和色譜—波譜聯(lián)用高通量結(jié)構(gòu)鑒定等,與高通量活性篩選技術(shù)相匹配,為快速測(cè)定各種天然產(chǎn)物樣品在不同靶點(diǎn)上的作用特性創(chuàng)造了條件,可在短時(shí)間內(nèi)獲取大量的結(jié)構(gòu)和活性信息。
6、藥物篩選常用的靶標(biāo)有哪些種類?
現(xiàn)代藥物研究開發(fā)的關(guān)鍵步驟是發(fā)現(xiàn)、確定和應(yīng)用藥物作用的靶分子,即藥物在體內(nèi)發(fā)揮療效的作用位點(diǎn),包括基因、酶、受體、離子通道和核酸等生物大分子,其中酶和受體的用途最廣。
(1)酶靶標(biāo)
設(shè)為藥靶的酶一般在疾病進(jìn)程中與病理性代謝途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白加工或免疫反應(yīng)等密切相關(guān)。酶的小分子抑制劑如抗腫瘤藥物氨甲蝶呤(二氫葉酸還原酶抑制劑)和5-氟尿嘧啶(尿嘧啶還原酶抑制劑)以及抗病毒藥物阿昔洛韋(逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)等在臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用。也有將關(guān)鍵酶的上游調(diào)節(jié)機(jī)制或把酶本身作為藥物的實(shí)例(如溶栓酶)。
基于酶動(dòng)力學(xué)的篩選方法操作簡(jiǎn)易,靈敏度高,適于高通量和自動(dòng)化。由于大部分反應(yīng)都是在均相狀態(tài)下進(jìn)行,可明顯減少實(shí)驗(yàn)誤差,也無需繁瑣的實(shí)時(shí)組織或細(xì)胞培養(yǎng),從而提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。然而,無論是天然或重組的酶蛋白在分離純化過程中都可因丟失某些關(guān)鍵成分或輔因子,或者摻入一些雜質(zhì)而影響酶的活性。其次,在人工條件下的檢測(cè)結(jié)果無法全面反映體內(nèi)多種復(fù)雜的調(diào)控和反饋機(jī)制。再次,很多作為藥靶的酶是與細(xì)胞膜相結(jié)合的,不易分離或分離后難以保證其生物活性。至于由多亞基組成的酶,如何在分離純化后保持原有活性仍然是一個(gè)技術(shù)難題。因此,在建模時(shí)必須對(duì)特定酶的生物學(xué)特性(如生理效應(yīng)、偶聯(lián)反應(yīng)、表達(dá)位點(diǎn)、組織分布、胞內(nèi)定位、前體蛋白和同工酶等)、物理化學(xué)特性(如溶解性、分子量、等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等)和反應(yīng)條件(離子濃度、pH值和純度要求等)有比較詳盡的了解。
(2)受體靶標(biāo)
受體包括膜受體和核受體兩類,占所有藥物作用靶點(diǎn)的60%以上。膜受體的種類繁多,包括G蛋白偶聯(lián)受體、配體門控離子通道、電壓門控離子通道、酪氨酸激酶受體等。G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors,GPCR)是目前已知藥靶中最重要的一類,約40%的市售處方藥以其為靶點(diǎn)。迄今發(fā)現(xiàn)的1000多種G蛋白偶聯(lián)受體盡管功能復(fù)雜多樣,但結(jié)構(gòu)卻非常保守,其特點(diǎn)為7個(gè)跨膜的α雙螺旋結(jié)構(gòu),其中N-端在胞外,C-端在胞內(nèi),通過相似的分子機(jī)制發(fā)揮生理作用,天然配體包括氨基酸、多肽、蛋白、脂肪酸和氣味分子等。
核受體是目前所知最大的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子超家族,通過與特異性配體作用調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平。根據(jù)配體的化學(xué)性質(zhì),核受體可分為三類:(1)類固醇激素受體;(2)非類固醇激素受體;(3)至今尚未發(fā)現(xiàn)其天然配體的孤兒型受體。核受體發(fā)揮生理功能的經(jīng)典途徑是與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合后激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)蛋白合成水平,引起相應(yīng)反應(yīng)。機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化和代謝凋亡等諸多生命過程都與核受體的作用密切相關(guān),是一類重要的藥物靶點(diǎn)。
受體結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的陽性化合物必須經(jīng)過在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的功能檢測(cè)才能確定其藥理學(xué)特征,即激動(dòng)劑、半激動(dòng)劑、拮抗劑或半拮抗劑。對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體而言,可以測(cè)定細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信使或效應(yīng)分子(如腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C和蛋白激酶C等)的活性或三磷酸肌醇及鈣離子濃度來間接反映受體的功能狀態(tài)。由于核受體的信號(hào)途徑非常復(fù)雜,精確定量其靶基因的活化水平十分困難,采用報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)則能克服這一技術(shù)屏障。在某些缺少內(nèi)源性受體及其下游信號(hào)通路必要組成的細(xì)胞中,通過共轉(zhuǎn)染方法引入受體及含有受配體應(yīng)答元件調(diào)控的報(bào)告基因,即可模擬受體的激活過程。根據(jù)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)后所產(chǎn)生報(bào)告分子(如綠色熒光蛋白或熒光素酶等)的水平來判斷被測(cè)樣品的活性。在實(shí)驗(yàn)體系中轉(zhuǎn)入監(jiān)測(cè)質(zhì)粒就能夠用于區(qū)分細(xì)胞毒性和拮抗效應(yīng)的差別。
7、常用的高通量篩選模型有哪些?
篩選模型是指用于檢測(cè)藥物作用的實(shí)驗(yàn)方法。由于高通量篩選要求反應(yīng)總體積小、特異性強(qiáng)和敏感性高,因此對(duì)于篩選模型也有較高的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。常用的篩選模型都在分子水平或細(xì)胞水平觀察藥物與靶點(diǎn)的相互作用,能夠直接認(rèn)識(shí)藥物效應(yīng)的基本機(jī)制。目前這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細(xì)胞反應(yīng)方面。近年也出現(xiàn)了基因水平的藥物篩選模型,使模型種類和涵蓋范圍更為廣泛。
(1)分子水平的藥物篩選模型:
① 受體篩選模型:指檢測(cè)受體與放射性配體結(jié)合的模型。以受體為作用靶點(diǎn)的篩選方法包括測(cè)定功能反應(yīng)、第二信使生成和標(biāo)記配體與受體相互作用等不同類型。
② 酶篩選模型:觀察藥物對(duì)酶活性的影響。根據(jù)酶的特點(diǎn),底物和產(chǎn)物都可以作為檢測(cè)指標(biāo),并由此確定反應(yīng)速度。典型的酶篩選包括(a)適當(dāng)緩沖液中孵化;(b)控制反應(yīng)速度,如:溫度、緩沖液的pH值和酶的濃度等;(c)測(cè)量產(chǎn)物的增加和底物的減少。
③ 離子通道篩選模型:舉例為(a)貝類動(dòng)物毒素高通量篩選的作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn),用放射性配體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來考察受試樣品的活性特征;(b)用酵母雙雜交的方法來高通量篩選能干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子,尋找新型鈣通道拮抗劑。
(2)細(xì)胞水平的藥物篩選模型:
主要觀察被篩樣品對(duì)細(xì)胞的作用,但不能反映藥物作用的具體途徑和靶標(biāo),僅反映藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等生理過程的綜合作用,包括細(xì)胞激活、凋亡、增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白分泌和離子流動(dòng)等。
8、高通量篩選技術(shù)采用那些檢測(cè)方法?
在液體移取、檢測(cè)儀器、數(shù)據(jù)處理和高密度微孔板應(yīng)用取得巨大進(jìn)展的同時(shí),檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步乃是提高篩選效率和命中率,使篩選系統(tǒng)完全自動(dòng)化的重要環(huán)節(jié)。均相篩選技術(shù)主要應(yīng)用于體外生物化學(xué)的檢測(cè),其靶點(diǎn)包括特定的酶、受體或離子通道,具有快速、價(jià)廉、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的篩選技術(shù),如受體配體結(jié)合、酶和細(xì)胞水平的篩選均為多步驟方法,通常會(huì)涉及到過濾、沉淀或吸收以及數(shù)次洗滌過程以分離結(jié)合與游離的配體或底物與產(chǎn)物。如曾經(jīng)非常流行的ELISA方法,包括幾次孵育和洗滌步驟,勞動(dòng)密集度高,即使優(yōu)化后,日篩選最大通量仍然小于5000樣次。而那些使用同位素標(biāo)記底物或配體的檢測(cè)方法,則會(huì)產(chǎn)生大量的放射性廢物。另外,這些實(shí)驗(yàn)技術(shù)均不能完全適用于自動(dòng)化操作,檢測(cè)過程中每增加一步都會(huì)延長(zhǎng)完成實(shí)驗(yàn)的時(shí)間,降低信號(hào),減少通量。而高通量均相篩選技術(shù)卻能彌補(bǔ)這些缺陷,日篩量可達(dá)一萬樣次以上,對(duì)于建立高效快速的篩選體系至關(guān)重要。
國(guó)際上近些年來發(fā)展了許多基于熒光、化學(xué)發(fā)光或放射性活性檢測(cè)的新技術(shù)。而更為新興的納米技術(shù),包括生物芯片及"量子球"(Quantum dots),使更高密集度形式的超高通量篩選成為可能。目前,基于熒光檢測(cè)技術(shù)的高通量篩選方法包括:熒光強(qiáng)度檢測(cè)、熒光偏振檢測(cè)、熒光共振能傳遞檢測(cè)、均相時(shí)間依賴熒光檢測(cè)或均相時(shí)間依賴熒光共振能傳遞檢測(cè)、共聚焦熒光顯微鏡、熒光成像分析和熒光報(bào)告基因檢測(cè)等?;诨瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的高通量篩選方法包括:電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)及Alpha篩選檢測(cè)等。基于放射性活性檢測(cè)技術(shù)的高通量篩選方法包括:近親閃爍檢測(cè)方法、FlashPlate閃爍檢測(cè)方法和LEADseeker均相成像檢測(cè)等。另外還有表面膜共振檢測(cè)、液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)和毛細(xì)管電泳?質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)等先進(jìn)的技術(shù)手段。
細(xì)胞分析技術(shù)能夠精確模擬活細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境,可用來驗(yàn)證化合物樣品對(duì)細(xì)胞功能的影響,如增殖分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄翻譯等。常用的手段有放射性標(biāo)記摻入法、四唑鹽還原法、Alamar Blue實(shí)驗(yàn)、BrdU摻入法以及用于區(qū)別細(xì)胞毒性和增殖能力的熒光氧氣探測(cè)技術(shù)等。
9、高通量篩選數(shù)據(jù)庫有哪些功能?
高通量藥物篩選的特點(diǎn)是對(duì)數(shù)以萬計(jì)的化合物樣品進(jìn)行隨機(jī)和平行的活性檢測(cè),產(chǎn)生海量的原始數(shù)據(jù),需要應(yīng)用高效的數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)進(jìn)行收集、存儲(chǔ)、處理、分析、整合和演繹,其主要功能如下:
(1)樣品信息的存儲(chǔ)功能
數(shù)據(jù)庫具有對(duì)用于高通量篩選的化合物樣品進(jìn)行存儲(chǔ)管理的功能。處理一般信息如理化性質(zhì)、純度、來源、存量、位置等外,對(duì)每一個(gè)新入庫的化合物都要事先進(jìn)行新穎性分析,排除結(jié)構(gòu)相同的化合物,避免重復(fù)篩選。由于高度反應(yīng)性基團(tuán)增加了假陽性出現(xiàn)的機(jī)率,在必要時(shí)還需對(duì)新入庫的化合物進(jìn)行反應(yīng)基因檢測(cè)。此外,數(shù)據(jù)庫也保存對(duì)樣品采取質(zhì)量控制和質(zhì)量保障措施的記錄。
(2)活性信息的管理功能
數(shù)據(jù)庫完整記錄對(duì)庫存每個(gè)化合物進(jìn)行不同模型篩選獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果,科研人員可以采用多種分析軟件依此對(duì)其生物活性作出綜合評(píng)價(jià)。
(3)藥物篩選的服務(wù)功能
高通量藥物篩選的工作量大,自動(dòng)化程度高,也涉及到許多后繼結(jié)果分析通報(bào)等繁瑣程序。數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)能夠?qū)εc藥物篩選相關(guān)的業(yè)務(wù)往來通訊、檔案管理以及各種樣品標(biāo)簽的打印進(jìn)行綜合管理,使對(duì)外篩選服務(wù)各個(gè)環(huán)節(jié)有序化、標(biāo)準(zhǔn)化和流水化。
(4)藥物發(fā)現(xiàn)的研究功能
高通量藥物篩選產(chǎn)生大量的生物活性信息,數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)利用這些信息,通過對(duì)在同一模型上呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析來判斷是否存在初步的構(gòu)效關(guān)系,或多種陽性結(jié)構(gòu)是否存在一般規(guī)律,從而為后繼研究提供參考。
10、自動(dòng)化操作系統(tǒng)是怎么工作的?
高通量藥物篩選在短時(shí)內(nèi)要對(duì)數(shù)以萬計(jì)的化臺(tái)物樣品進(jìn)行活性檢測(cè),內(nèi)容枯燥、步驟重復(fù),人工操作容易因疲勞而出錯(cuò)。自動(dòng)化操作系統(tǒng)采用微孔板作為反應(yīng)容器,具有固定的分布模式(Format),不同的微孔板通過條形碼加以標(biāo)記。自動(dòng)化操作系統(tǒng)通過光電閱讀器對(duì)特定微孔板上的特定位置進(jìn)行操作,并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)存貯在計(jì)算機(jī)內(nèi),從而使篩選過程快速有序,平行可控,易于重現(xiàn),結(jié)果準(zhǔn)確。
自動(dòng)化操作系統(tǒng)利用計(jì)算機(jī)通過操作軟件控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。操作軟件采用實(shí)物圖像代表實(shí)驗(yàn)用具,簡(jiǎn)潔明了地以圖示顯現(xiàn)機(jī)器的動(dòng)作??蒲腥藛T可以自行編程,過程簡(jiǎn)單,便于操作。自動(dòng)化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組成都分,根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫孵和離心等設(shè)備以進(jìn)行相應(yīng)的步驟。
除了實(shí)驗(yàn)步驟的需要以外,自動(dòng)化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。目前主要有單孔、8孔、96孔和384孔等幾種低中密度微孔板。單孔板一般用于對(duì)照樣品以及復(fù)篩中零散樣品的轉(zhuǎn)移。96孔和384孔板在酶活性檢測(cè)和需要同時(shí)開始與終止反應(yīng)的篩選模型中是必需的。
自動(dòng)化操作系統(tǒng)的另一個(gè)重要組成部分是堆棧(Hotel)。所謂堆棧是指在操作過程中用來放置樣品板、反應(yīng)板以及對(duì)它們進(jìn)行轉(zhuǎn)移所需的騰挪空間。因此,高通量篩選的樣品數(shù)量取決于堆棧的容量。
我們都知道,生藥的化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜,通過提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物,所以篩選前需要對(duì)生藥的提取物進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x。在眾多的分離手段中,制備型HPLC應(yīng)該是最為理想的,它具有快速、高效、自動(dòng)化等諸多優(yōu)點(diǎn)。
由此可見,高通量藥物篩選的自動(dòng)化操作系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)及其操作軟件、自動(dòng)化加樣、沖洗、溫孵和離心等設(shè)備以及堆棧這4個(gè)部分組成。不同的單位可根據(jù)模型類型和篩選規(guī)模選購(gòu)不同的組分整合成為一個(gè)完整的操作系統(tǒng)。
11、高通量篩選系統(tǒng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是什么?
對(duì)高通量篩選系統(tǒng)的正確評(píng)價(jià)可以判斷整個(gè)藥物篩選實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量和由此所獲得結(jié)果之可靠性,主要指標(biāo)包括可行性、穩(wěn)定性、靈敏性和特異性,并引進(jìn)了一些電子工程學(xué)的專業(yè)術(shù)語,如信號(hào)本底比(S/B)和信噪比(S/N)等。信號(hào)本底比反映實(shí)驗(yàn)中信號(hào)平均值與本底平均值之間的差距。一般來講,S/B值越大,信號(hào)與本底的差距就越大,篩選模型對(duì)被測(cè)樣品的區(qū)分度越大。在高通量篩選中一般要求S/B值大于3。信噪比是儀器分析中常用的評(píng)價(jià)參數(shù)。噪音系指在同樣的條件下,本底所產(chǎn)生的記錄信號(hào)。一般要求高通量篩選實(shí)驗(yàn)的S/N值大于10。
Z’因子巧妙地把信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化區(qū)間和信號(hào)變異性相結(jié)合,進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)分析,彌補(bǔ)了單獨(dú)使用信號(hào)本底比或信噪比的不足,因而被廣泛接受,成為評(píng)價(jià)高通量藥物篩選質(zhì)量的最重要指標(biāo)。Z’因子與S/B值和CV(變異系數(shù))都有直接而密切的關(guān)系并以下式表示:
Z’因子假定信號(hào)值和本底值的總體呈正態(tài)分布,而變異是由隨機(jī)誤差引起的,因而它能夠反應(yīng)信號(hào)值和本底值總體的分布。Z’因子是一個(gè)無綱量參數(shù),它的絕對(duì)值從1~0。如果信號(hào)值總體與本底值總體重疊,Z’=0。一般要求Z’因子大于0.4,即S/B=3、CV=10%,達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)的高通量藥物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果才可接受。
在初建篩選模型時(shí),必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算陽性對(duì)照物的EC50值或IC50值,與文獻(xiàn)報(bào)道值進(jìn)行比較可以基本判斷模型的可行性。計(jì)算值與報(bào)道值在一定范圍(一到兩個(gè)數(shù)量級(jí))內(nèi)的差異對(duì)篩選結(jié)果的評(píng)估影響不大。
12、什么是高內(nèi)涵藥物篩選?
雖然由高通量獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為準(zhǔn)確,易于評(píng)價(jià),但其檢測(cè)模型均建立在單個(gè)藥物作用靶分子的基礎(chǔ)上,無法全面反映被篩樣品的生物活性特征,如化合物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的多種特異效應(yīng)包括毒性作用。顯微熒光標(biāo)記、數(shù)碼影像分析以及圖像數(shù)據(jù)處理技術(shù)的快速發(fā)展,使以高通量方式對(duì)細(xì)胞的多個(gè)生理環(huán)節(jié)進(jìn)行檢測(cè)成為可能,有力地推動(dòng)了藥物篩選技術(shù)由高通量篩選向高內(nèi)涵篩選(High content screening, HCS)發(fā)展的革命性轉(zhuǎn)變。高內(nèi)涵篩選是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下,同時(shí)檢測(cè)被篩樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響,在單一實(shí)驗(yàn)中獲取大量相關(guān)信息,確定其生物活性和潛在毒性。從技術(shù)層面而言,高內(nèi)涵篩選是一種應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng),在細(xì)胞水平上檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)的多元化、功能性篩選技術(shù),旨在獲得被篩樣品對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的多維立體和實(shí)時(shí)快速的生物效應(yīng)信息。高內(nèi)涵篩選技術(shù)的檢測(cè)范圍包括:靶點(diǎn)激活、細(xì)胞凋亡、分裂指數(shù)、蛋白轉(zhuǎn)位、細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移、受體內(nèi)化、細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。
業(yè)界人士認(rèn)為,高內(nèi)涵篩選不僅能闡明被篩樣品與藥靶的相互作用關(guān)系,而且可同時(shí)了解細(xì)胞的其他生物學(xué)改變,進(jìn)而研究其對(duì)相關(guān)代謝途徑的影響,并通過觀察細(xì)胞形態(tài)來預(yù)測(cè)化合物的毒性。應(yīng)用高內(nèi)涵篩選技術(shù)能夠加速發(fā)現(xiàn)具有潛在開發(fā)前景的活性化合物,設(shè)定深入評(píng)價(jià)的優(yōu)先次序,為構(gòu)效關(guān)系研究和結(jié)構(gòu)優(yōu)化改造提供有力的支持。因此,高內(nèi)涵篩選代表著創(chuàng)新藥物研究技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。
13、要進(jìn)行高內(nèi)涵藥物篩選需要什么基本設(shè)備?
開發(fā)高內(nèi)涵篩選技術(shù)的最初目的是對(duì)樣品在細(xì)胞水平進(jìn)行功能性檢測(cè)。美國(guó)Cellomics公司研制的ArrayScan HCS Reader是第一臺(tái)專用于高內(nèi)涵篩選的儀器,既可以單獨(dú)使用,也能夠與其他自動(dòng)化設(shè)備聯(lián)用。目前已有相當(dāng)數(shù)目的儀器生產(chǎn)廠商開始研制這類儀器。制造商一般采用白色連續(xù)光源(或比較昂貴的激光光源)、多通道濾光片(適于常用的熒光染料)和CCD照相機(jī)分析固定細(xì)胞。對(duì)于活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)分析而言,白色連續(xù)光源因?qū)θ玖系拇銣缱饔眯『蛯?duì)細(xì)胞的光毒性低比激光更具優(yōu)勢(shì),且可以長(zhǎng)時(shí)間記錄,適合于動(dòng)力學(xué)研究。目前,高內(nèi)涵篩選技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)從功能鑒定逐漸拓展到靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、靶點(diǎn)驗(yàn)證、活性初篩、代謝及毒理等研究領(lǐng)域,顯示了巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/span>
圖像采集、圖像分析和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存是高內(nèi)涵藥物篩選設(shè)備的主要組成部分。其中用于圖像分析的"生物應(yīng)用軟件"(BioApplications)大致可以分為兩種:一種是針對(duì)某類特定生物學(xué)反應(yīng)而設(shè)計(jì)的,研究人員能夠在一定程度上通過修改參數(shù)來適應(yīng)檢測(cè)精度的需要;另一種為通用模板,使用者可以根據(jù)不同參數(shù)的自由組合來設(shè)計(jì)自己的應(yīng)用軟件。
實(shí)施高通量的高內(nèi)涵分析在單位時(shí)間里會(huì)產(chǎn)生和采集數(shù)以萬計(jì)的圖像,必須及時(shí)處理和妥善保存。一個(gè)完整的高內(nèi)涵篩選技術(shù)系統(tǒng)應(yīng)該包括具有一定開放性的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)庫,對(duì)不同來源的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一的分析和管理,同時(shí)允許研究人員從其他計(jì)算機(jī)終端調(diào)取信息,分析研究。
14、可否例舉幾個(gè)高內(nèi)涵藥物篩選的應(yīng)用實(shí)例?
(1)受體功能檢測(cè)
G蛋白偶聯(lián)受體是最大的細(xì)胞表面受體家族,目前雖有200余個(gè)已經(jīng)找到相應(yīng)配體,但在人類基因組編碼超過1000個(gè)的G蛋白偶聯(lián)受體中仍有相當(dāng)?shù)臄?shù)量不明其功能或配體,即孤兒型受體,為藥物靶點(diǎn)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。這類受體的功能性研究大多基于胞內(nèi)鈣流測(cè)定、報(bào)告基因表達(dá)或受體內(nèi)化檢測(cè)。激動(dòng)劑與受體結(jié)合引起后者構(gòu)象改變而激活G蛋白,由此進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游分子靶標(biāo)(如核苷環(huán)化酶、磷脂酶和激酶等)的活性,通過不同蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化受體磷酸化,與?-arrestins結(jié)合,發(fā)生G蛋白解聚,最終出現(xiàn)受體內(nèi)吞。
多種自發(fā)性熒光蛋白的應(yīng)用使得以細(xì)胞成像技術(shù)開展配體研究成為可能。在確立大多數(shù)G蛋白偶聯(lián)受體被激動(dòng)后從細(xì)胞表面內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi)這一普遍現(xiàn)象后多年,科學(xué)家才利用在β-腎上腺素受體C末段連接綠色熒光蛋白(GFP)的方式直觀地記錄了整個(gè)過程。研究表明,在受體C-末端連接熒光多肽不會(huì)干擾配體的結(jié)合,因而此技術(shù)可用于構(gòu)建各種工程細(xì)胞株為篩選服務(wù)。Hirasawa等人曾經(jīng)報(bào)告了利用GFP標(biāo)記的受體以內(nèi)吞為指標(biāo)篩選孤兒受體GPR120配體的研究,發(fā)現(xiàn)不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸可以激活該受體并刺激腸道分泌胰高血糖素樣肽-1,最終導(dǎo)致胰島素的分泌。β-arrestin與G蛋白偶聯(lián)受體的相互作用對(duì)籠形蛋白(Clathrin)介導(dǎo)的受體內(nèi)吞是非常關(guān)鍵的,這一作用能被以GFP標(biāo)記的β-arrestin可視化。只有高親和作用型的G蛋白偶聯(lián)受體才能與β-arrestin同時(shí)內(nèi)吞,GFP在細(xì)胞內(nèi)重新分布,形成易于分辨和計(jì)數(shù)的點(diǎn)狀小體,供研究者定量分析。
此外,也有人運(yùn)用對(duì)pH 敏感的染料來監(jiān)測(cè)G蛋白偶聯(lián)受體的活性。CypHer-5是一種對(duì)酸度敏感的花青素(Cyanine)染料衍生物,pK 值為6.1,在酸性環(huán)境下可以檢測(cè)到其產(chǎn)生的熒光。如果在受體的N-末端進(jìn)行表位附加(Epitope tagging),選擇標(biāo)記CypHer-5的抗體進(jìn)行染色,只是在受體激活后發(fā)生內(nèi)吞進(jìn)入酸性的內(nèi)體(Endosome)時(shí)染料才會(huì)發(fā)出紅色熒光并被檢測(cè)到。實(shí)踐表明,這種方法對(duì)Gs、Gi和Gq等結(jié)合的受體都適用,信號(hào)干擾少,可與綠色熒光蛋白標(biāo)記平行使用。
(2)細(xì)胞毒性研究
早期、快速和體外毒性評(píng)價(jià)是提高藥物發(fā)現(xiàn)效率和準(zhǔn)確度之關(guān)鍵所在。當(dāng)前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)高通量化的細(xì)胞毒性檢測(cè)技術(shù)主要分為兩類:一是基于線粒體活性的方法,如MTT法、Alamar Blue法和ATP生物發(fā)光法等;其次是基于細(xì)胞膜通透性的熒光染色法,如Propidium iodide等。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡通路的不斷認(rèn)識(shí),上述僅僅判斷細(xì)胞死亡而無法區(qū)分凋亡與壞死差別的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法已不能滿足科研人員的需要了。
細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡,通過一系列嚴(yán)密調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn),是機(jī)體主動(dòng)、有序清除過?;蛩ダ霞?xì)胞的生理機(jī)制。細(xì)胞凋亡早期會(huì)有磷脂酰絲氨酸外翻、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變和線粒體膜電位變化等反應(yīng),在晚期則出現(xiàn)細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞核裂解為碎塊產(chǎn)生凋亡小體等現(xiàn)象。而細(xì)胞壞死是一個(gè)被動(dòng)的、因損傷而引起的細(xì)胞解體、釋放內(nèi)容物之過程,往往伴隨炎癥反應(yīng)等病理機(jī)制。熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀配合適當(dāng)?shù)臒晒馊玖鲜菂^(qū)分凋亡或壞死最常用的手段。
高內(nèi)涵篩選方法使實(shí)現(xiàn)熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡高通量化成為可能。Vogt等人以3種熒光染料分別標(biāo)記細(xì)胞核、線粒體和微管,應(yīng)用ArrayScan?對(duì)圖像進(jìn)行自動(dòng)采集和分析,根據(jù)細(xì)胞密度、核形狀、線粒體聚集狀況以及微管形態(tài)變化等指標(biāo)系統(tǒng)地分析了兩個(gè)抗腫瘤藥物(平陽霉素和紫杉醇)的毒性及其作用機(jī)理,體現(xiàn)了明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。L?vborg及其同事也利用類似的辦法評(píng)估了一種新型細(xì)胞毒藥物(CHS828)的毒理學(xué)特性,結(jié)果滿意。利用特定的生物應(yīng)用程序(如Cell Health Profiling BioApplication)可以通過對(duì)不同檢測(cè)指標(biāo)展開組合旨在分析凋亡進(jìn)程。
(3)信號(hào)通路分析
細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路本身和相互之間的交流調(diào)控方式極其復(fù)雜,傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法(如Western blot、凝膠遷移滯后檢測(cè)和報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng))繁瑣耗時(shí),無法研究單細(xì)胞反應(yīng)。由于轉(zhuǎn)錄因子的核位移能以免疫熒光標(biāo)記方法可視化,高內(nèi)涵篩選技術(shù)使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的高通量化研究成為可能。NF-?B通路在炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用。IL-1和TNF?等許多細(xì)胞因子都是通過激活NF-?B通路來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的。Ding等人在1998年成功運(yùn)用ArrayScan?定量分析了由IL-1和TNF?誘導(dǎo)的NF-?B核位移。國(guó)家新藥篩選中心的科研人員最近利用同樣的方法確定了傳統(tǒng)中草藥瑞香狼毒的主要成分-異狼毒素的生物效應(yīng)是由NF-?B通路所介導(dǎo)的。
MAPKs通路是另一條涉及多種功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在抗腫瘤藥物的篩選研究中尤為重要。ERKs是MAPKs的一個(gè)亞家族,活化后參與許多細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng),包括磷酸化重要的胞漿或膜蛋白、自身核轉(zhuǎn)位、磷酸化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而引起細(xì)胞分裂或分化。由于MAPKs能被多種受體激活,轉(zhuǎn)導(dǎo)多條信號(hào)通路,其功能必須受到嚴(yán)密的控制。高內(nèi)涵篩選技術(shù)為能針對(duì)性地研究特定受體與某種MAPKs之間的關(guān)系提供了便利。例如,Ghosh等科研人員使用紅色熒光標(biāo)記的EGF刺激細(xì)胞而啟動(dòng)內(nèi)吞,熒光標(biāo)記配體與EGF受體結(jié)合后激活ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路造成ERK的磷酸化和核轉(zhuǎn)位,兩個(gè)反應(yīng)在同一細(xì)胞內(nèi)被同時(shí)檢測(cè)量化并進(jìn)行相關(guān)性研究,極大地提高了實(shí)驗(yàn)效率和降低了成本耗費(fèi)。
(4)細(xì)胞形態(tài)觀測(cè)
細(xì)胞的生理或病理反應(yīng)往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變,如細(xì)胞器、大分子簇或細(xì)胞骨架在細(xì)胞內(nèi)的位移;整個(gè)細(xì)胞形態(tài)或面積改變?nèi)缟窠?jīng)細(xì)胞分化;細(xì)胞間距改變;細(xì)胞群落的形狀、大小和其中每個(gè)細(xì)胞位置的變化等。這些變化有的是與正常的生理過程相關(guān)的,如受體內(nèi)化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、遷移運(yùn)動(dòng)、有絲分裂和細(xì)胞分化等,而另一些則是受到外來刺激(包括化合物)后產(chǎn)生的:既可能同時(shí)發(fā)生,也可能以級(jí)聯(lián)反應(yīng)的形式出現(xiàn)。高內(nèi)涵篩選技術(shù)自動(dòng)定量和統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞形態(tài)變化的功能為高信息量地開展細(xì)胞生物學(xué)研究提供了強(qiáng)大的武器。Ghosh和Haskins報(bào)道了一個(gè)能自動(dòng)對(duì)熒光標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)區(qū)分和定量分析的生物應(yīng)用軟件(Morphology Explorer BioApplication),使用者可從3個(gè)層面來研究細(xì)胞的形態(tài)改變:①全細(xì)胞形態(tài);②亞細(xì)胞形態(tài);③多細(xì)胞或細(xì)胞間形態(tài)改變。其中全細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)包括了形狀、大小、突起的數(shù)量、長(zhǎng)短和方向;亞細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)包括了細(xì)胞內(nèi)顆?;蚶w維的位置、數(shù)量和走向等;多細(xì)胞檢測(cè)包括了細(xì)胞群落或多核細(xì)胞的外形、各細(xì)胞或核的分布情況等?;衔锎碳せ蚺囵B(yǎng)條件的改變有可能導(dǎo)致細(xì)胞骨架重新排列,從而使得細(xì)胞整體形態(tài)發(fā)生改變或者引起細(xì)胞之間距離或位置的變化。高內(nèi)涵技術(shù)手段不僅可以快速記錄這些形態(tài)變化,而且能夠有效分析單一或混合培養(yǎng)細(xì)胞的群落形成、細(xì)胞鋪展、胞內(nèi)顆粒以及神經(jīng)突觸等現(xiàn)象,使篩選信息在多種層次上得以采集演繹。
(5)動(dòng)態(tài)分析檢測(cè)
早期活細(xì)胞功能檢測(cè)所使用的染料大多是有機(jī)小分子,旨在測(cè)定細(xì)胞內(nèi)金屬離子濃度(如Ca2+等)、膜電位變化、細(xì)胞器定位和功能(如線粒體電位改變)等。隨著熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷成熟和在細(xì)胞生物學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用,熒光標(biāo)記開始向大分子方向發(fā)展。運(yùn)用綠色熒光蛋白及其變異體使許多生物大分子的表達(dá)、分布、活化和位移過程可視直觀。最近又有人把一類穩(wěn)定性高、易于修飾、可發(fā)熒光的過渡金屬硫化物應(yīng)用到生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究中,即"量子球"技術(shù),其應(yīng)用前景無限廣闊。自動(dòng)熒光顯微技術(shù)和先進(jìn)熒光試劑的產(chǎn)生使活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)可視研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代。
雖然上述高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)技術(shù)經(jīng)過短短數(shù)年的發(fā)展已經(jīng)逐步整合到高通量藥物篩選的實(shí)踐中,但它仍然處在早期階段,在儀器制造、圖像處理和運(yùn)轉(zhuǎn)速效等方面都有待于進(jìn)一步的提高。標(biāo)記分子、常用試劑的開發(fā)也必須超越GFP和現(xiàn)有的熒光染料,以便開展更多的活細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)。最后,包括機(jī)器、試劑、耗材和軟件在內(nèi)的市售價(jià)格之實(shí)質(zhì)性降低必將促進(jìn)這項(xiàng)先進(jìn)技術(shù)的推廣與普及。
參考資料:https://screen.org.cn/2710.shtml
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