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苯甲醇是一種重要的中間體，能用于化學(xué)、制藥和聚合物工業(yè)中許多不同化合物的商業(yè)制備。目前苯甲醇的工業(yè)生產(chǎn)利用甲苯作為原料，通過化學(xué)法生成，該過程繁瑣且會(huì)生成大量副產(chǎn)物污染環(huán)境。因此，如何發(fā)展苯甲醇的綠色高效生產(chǎn)方法一直是工業(yè)界和學(xué)術(shù)界共同關(guān)注的問題。

近日，湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李愛濤教授、陳純琪教授、郭瑞庭教授團(tuán)隊(duì)共同合作，成功解決了這一難題。他們首次解析了P450tol及其復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)，并基于此構(gòu)建了一種活性和穩(wěn)定性均明顯提升的人工融合酶，實(shí)現(xiàn)了苯甲醇的高效綠色合成，相關(guān)研究成果發(fā)表于國際權(quán)威期刊ACS Catalysis，并選為封面文章 (圖1)。

圖1.本研究獲選為ACS Catalysis封面文章。

萬能酶P450的神奇定向進(jìn)化

在我們生活的地球上，“進(jìn)化”是一股強(qiáng)大的力量。酶，這種地球上生命中最強(qiáng)大的化學(xué)工具，通過理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化手段，展現(xiàn)出了在生物催化領(lǐng)域的強(qiáng)大功能。其中，細(xì)胞色素P450酶能夠識(shí)別多種底物（參與生化反應(yīng)的物質(zhì)），利用基因工程改造P450酶來量身定制化學(xué)反應(yīng)，成為一個(gè)熱門研究方向。2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主阿諾德教授，就是利用P450酶的定向進(jìn)化實(shí)現(xiàn)各種特殊的化學(xué)反應(yīng)而獲獎(jiǎng)。

惰性C?H鍵的官能團(tuán)化被認(rèn)為是有機(jī)化學(xué)的圣杯，然而C?H鍵具有較高的解離能，通常具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性和較低的化學(xué)反應(yīng)性，因此，C?H鍵官能團(tuán)化是傳統(tǒng)化學(xué)合成中一個(gè)極大的難題。以重要的工業(yè)中間體苯甲醇為例，工業(yè)生產(chǎn)采取兩步法，以甲苯為原料，需要用到劇毒的氯氣和強(qiáng)堿氫氧化鈉，并產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物 (圖2)。

圖2.苯甲醇化學(xué)合成方法

在前期研究中，湖北大學(xué)李愛濤教授從甲苯降解菌中鑒定了一種特殊的P450酶，命名為P450tol，它以甲苯為底物，生成專一的產(chǎn)物苯甲醇，這是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一可以天然催化甲苯生成苯甲醇的酶。然而，P450tol三維結(jié)構(gòu)信息的缺乏，限制了針對(duì)P450tol的基礎(chǔ)研究與未來的應(yīng)用。

揭開特殊P450酶的神秘面紗

要改造高效的P450tol，必須揭開酶結(jié)構(gòu)的面紗。為此，李愛濤教授與郭瑞庭教授團(tuán)隊(duì)強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手。2020年5月，郭瑞庭教授團(tuán)隊(duì)成為世界上首次解析自給自足P450酶的全長(zhǎng)晶體結(jié)構(gòu)的團(tuán)隊(duì)，并獲得了廣泛的關(guān)注和贊譽(yù)。這次的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手合作，一舉解開了P450tol的結(jié)構(gòu)謎團(tuán)。

在這項(xiàng)研究中，郭瑞庭、陳純琪團(tuán)隊(duì)順利解析了P450tol的空結(jié)構(gòu)以及與底物甲苯及產(chǎn)物苯甲醇的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。通過這些結(jié)構(gòu)信息，精準(zhǔn)的揭示了P450tol由甲苯通過一步反應(yīng)生成苯甲醇，且反應(yīng)沒有副產(chǎn)物生成的結(jié)構(gòu)機(jī)制。

陳純琪教授介紹，P450酶的活性區(qū)都會(huì)帶一個(gè)血紅素分子參與催化反應(yīng)，他們解析的P450tol也不例外。底物甲苯位于由一系列疏水的氨基酸組成的口袋中，甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子，兩個(gè)氨基酸(F329和A279)分別位于底物的兩側(cè)，牢牢鉗住了甲苯的苯環(huán)，甲苯前方還有一個(gè)氨基酸(V326)負(fù)責(zé)固定整個(gè)甲苯的位置(圖3A)，這樣催化反應(yīng)發(fā)生時(shí)就可以精確的發(fā)生在芐基位，而不是其它任意的位置，如此精巧的反應(yīng)也只有酶可以做到了。另外，他們?cè)赑450tol與苯甲醇的復(fù)合體結(jié)構(gòu)中也看到了類似的現(xiàn)象，只不過苯甲醇的羥基代替甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子(圖3B)”。

此外，他們也觀察到了一個(gè)非常有意思的現(xiàn)象，甲苯或苯甲醇并不能將P450tol的活性區(qū)完全占據(jù)，還有一些多余的空間，所以他們猜測(cè)P450tol或許可以結(jié)合比甲苯或苯甲醇更大一些的底物。復(fù)合體結(jié)果與他們推測(cè)的一致，P450tol也可以與一些鹵代甲苯形成復(fù)合體，且可以精確的在芐基位發(fā)生羥基化反應(yīng)，所有這些結(jié)果都顯示，配體會(huì)以有利于反應(yīng)發(fā)生的方式結(jié)合并參與反應(yīng)，這也使酶的反應(yīng)更精準(zhǔn)而高效。

        圖3. P450tol及復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)。(A)P450tol與甲苯復(fù)合體結(jié)構(gòu)及活性區(qū)關(guān)鍵氨基酸；(B)P450tol與苯甲醇復(fù)合體結(jié)構(gòu)及活性區(qū)關(guān)鍵氨基酸。

人工融合酶實(shí)現(xiàn)苯甲醇高效綠色合成

自然界中大部分的P450酶都需要一個(gè)能夠與之匹配的還原酶來提供電子以發(fā)生催化反應(yīng)，這對(duì)于后續(xù)的應(yīng)用是一個(gè)難題。為了實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用，尋找天然的自給自足型P450酶或者索性構(gòu)建高效的自給自足型P450人工融合酶成為科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。

“2020年5月，郭瑞庭團(tuán)隊(duì)解析的自給自足型P450酶(CYP116B46)的全長(zhǎng)晶體結(jié)構(gòu)，給我們構(gòu)建自給自足型人工融合酶帶來了非常大的啟發(fā)。”李愛濤教授說，他們將P450tol和CYP116B46的還原酶結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建的自給自足型人工融合酶 (圖4)不論在酶活性、穩(wěn)定性、還是半衰期都獲得了很大的提升。目前，P450tol和CYP116B46的融合是世界上首例報(bào)道的穩(wěn)定性和活性均大幅提升的人工融合酶，有很大的希望應(yīng)用于實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)中。

圖4.自給自足型人工融合酶P450tol-CYP116B46構(gòu)建。

不僅如此，P450tol-CYP116B46還可以催化丙基苯在近末端或芐基位區(qū)域選擇和立體選擇羥基化 (圖5A)，這些羥基化產(chǎn)物中，有些是非常重要的藥物中間體。我們也基于P450tol的三維結(jié)構(gòu)，使用蛋白質(zhì)工程的手段理性設(shè)計(jì)和改造，使其反應(yīng)更多的朝向人類有益的方向發(fā)生(圖5B和5C)。

圖5. P450tol-CYP116B46催化丙基苯(3)羥基化反應(yīng)。(A)P450tol-CYP116B46催化丙基苯生成的可能的羥基化產(chǎn)物((S)-或(R)-4; (S)-或(R)-5)；(B) 基于P450tol晶體結(jié)構(gòu)與丙基苯分子對(duì)接及活性區(qū)關(guān)鍵氨基酸；(C)使用HPLC檢測(cè)P450tol-CYP116B46及突變體羥基化丙基苯的產(chǎn)物。

“在未來的研究領(lǐng)域，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、人工智能、酶定向進(jìn)化等的大力發(fā)展，通過理性設(shè)計(jì)和改造，獲得更多新的具有重要功能的酶來造福于人類，將會(huì)是一個(gè)重要的研究和發(fā)展方向，我們也將繼續(xù)致力于更多P450tol人工融合酶的構(gòu)建，期待獲得更具挑戰(zhàn)的新反應(yīng)和性能獲得極大提升的新酶。”郭瑞庭教授表示。

論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscatal.1c05845