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（圖片來源：Nat. Chem.）

接下來，作者又合成了含吲哚基團的骨架5，6，7a-d和橋聯(lián)基團8，又經(jīng)過兩步合成得到了5-endo-trig型Cy5衍生物2a和2b。同時，5-exo-trig型Cy5衍生物4a和4b可以經(jīng)甲基酯中間體和LiAlH₄還原兩步合成得到（Fig.2a）。為了評價關(guān)環(huán)異構(gòu)體的穩(wěn)定性，作者對Cy5衍生物進行了pH滴定（Fig.2b）。實驗結(jié)果表明5-endo-trig型探針游離在細胞中能夠表現(xiàn)出明亮的發(fā)光，而5-exo-trig型探針在酸性環(huán)境中才會發(fā)光。在活細胞成像中，5-endo-trig型探針2a和2b在線粒體中表現(xiàn)出明亮的熒光（Fig.2c）。此外，作者合成了靶向性探針11（Fig.2d）。該染料的吸光度增加了約10倍，當與純化的SNAP-tag蛋白培育后其熒光強度提升了21倍（Fig.2e），由此可證明在與自標記標簽蛋白結(jié)合后染料的熒光性能增強。后續(xù)的實驗表明探針11還具有自發(fā)閃爍特性，從而可被用于對細胞微管結(jié)構(gòu)的單分子超分辨成像當中（Fig.2f）。

（圖片來源：Nat. Chem.）

作者又利用5-endo-trig策略合成含吲哚基團的化合物13和Cy5探針14（Fig.3a）。將含炔的衍生物與芐基鳥嘌呤10進行偶聯(lián)后可得探針15和16（Fig.3b）。染料15與純化后的SNAP-tag蛋白培育后吸光度增強了19倍，熒光強度增強了19倍。對比之下，染料16的吸光度和熒光強度分別提高了1.4倍和2.5倍（Fig.3c），探針15則與JF646系列染料的熒光性能相當。此外，作者驗證了染料15、16和JF646是否可以作為免洗探針用于活細胞成像。熒光成像結(jié)果表明探針15和JF646的表現(xiàn)相當（Fig.3d）。作者還制備了肌動蛋白靶向的探針17-actin和DNA靶向探針18-DNA（Fig.3e, f）。體外實驗中，探針17與肌動蛋白結(jié)合后的吸光度增加了11倍，熒光強度提升了313倍?；罴毎上裰刑结?strong style=";padding: 0px;outline: 0px;max-width: 100%;box-sizing: border-box !important;overflow-wrap: break-word !important">17更是能選擇性靶向HeLa細胞中的肌動蛋白。同時，探針18與DNA結(jié)合后的吸光度增加了7倍，熒光強度提升了32倍。以上結(jié)果表明經(jīng)5-endo-trig策略合成的Cy5衍生物可進行多種靶向性修飾后用于生物成像。

（圖片來源：Nat. Chem.）

最后，作者合成了Cy3的衍生物19和Cy7的衍生物20用于標記SNAP-tag（Fig.4a），探針19和20在與該蛋白結(jié)合后吸光度分別提升了6倍和11倍，熒光強度分別增加了28倍和124倍（Fig.4b）。此外，探針15，19和20的發(fā)射光譜覆蓋一部分可見光區(qū)并延伸到了近紅外區(qū)域。在與SNAP-tag結(jié)合后探針15和20表現(xiàn)出明亮的發(fā)光和良好的光學穩(wěn)定性（Fig.4c, d）。此外，作者結(jié)合使用Cy5染料15和JF549-Halo染料用于多路復(fù)合成像當中（Fig.4e）。如Fig.4e 所示，Cy3衍生物19和JF549-Halo的激發(fā)和發(fā)射波長范圍相近，作者利用其激發(fā)態(tài)壽命的差異對其進行了熒光壽命成像（FLIM）。成像結(jié)果表明盡管兩種探針的波長相近，但是基于染料19（激發(fā)態(tài)壽命2 ns）和染料JF549-Halo（激發(fā)態(tài)壽命4 ns）壽命的不同，仍可以對其發(fā)光信號進行分離（Fig.4f, g）。

（圖片來源：Nat. Chem.）