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光酶催化劑可以實(shí)現(xiàn)高立體選擇性的自由基反應(yīng)，主要是由于轉(zhuǎn)化可以發(fā)生在可調(diào)節(jié)的酶活性位點(diǎn)內(nèi)。當(dāng)將黃素蛋白（flavoproteins）用于非天然光酶反應(yīng)時(shí)，通常使用還原機(jī)理來引發(fā)自由基。而通過氧化機(jī)理來實(shí)現(xiàn)自由基的形成將會(huì)豐富自由基前體的官能團(tuán)類別，如胺和羧酸等。然而，激發(fā)態(tài)黃素在許多蛋白質(zhì)中是短壽命的，因?yàn)樗鼤?huì)被蛋白質(zhì)骨架快速淬滅。最近，美國普林斯頓大學(xué)Todd K. Hyster課題組報(bào)道了在黃素依賴的“烯”還原酶中添加外源的Ru(bpy)₃²⁺輔助因子，使氨基酸與乙烯基吡啶的氧化還原-中性脫羧偶聯(lián)具有高產(chǎn)率和高對(duì)映選擇性。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了立體互補(bǔ)的酶來分別實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物兩個(gè)對(duì)映體的合成（Fig. 1）。下載化學(xué)加APP到你手機(jī)，更加方便，更多收獲。

（圖片來源：Nat. Catal.）

首先，作者選擇N-苯基甘氨酸1a和烯基吡啶2a作為模板底物，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行了探索（Fig. 2）。通過對(duì)一系列酶的篩選，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用1a (10 μmol, 1 equiv.), 2a (35 μmol, 3.5 equiv.), 純凈的 OYE3 (1 mol%), Ru(bpy)₃Cl₂·6H₂O (1 mol%), NADP⁺ (1 mol%), GDH-105 (0.3 mg ml^?1) , 葡萄糖 (1.5 equiv.), Tris buffer (900 μl,100 mM, pH 7.6)和 DMSO (150 μl, 14% v/v) 作共溶劑，在藍(lán)光照射下室溫反應(yīng)14小時(shí)可以以90%的產(chǎn)率，93:7的er得到脫羧烷基化產(chǎn)物(S)-3（entry 2）。控制實(shí)驗(yàn)證實(shí)了實(shí)現(xiàn)此轉(zhuǎn)化的重要因素（entries 5-10）：當(dāng)移除OYE3時(shí)，偶聯(lián)反應(yīng)是可以發(fā)生的，以71%的產(chǎn)率得到外消旋體產(chǎn)物。由此表明光催化劑可以在沒有蛋白質(zhì)存在的情況下促進(jìn)自由基的引發(fā)和終止。相反，當(dāng)移除光催化劑時(shí)，產(chǎn)率僅為2%，但er為97:3，由此表明該蛋白負(fù)責(zé)自由基的終止。當(dāng)去除輔助因子翻轉(zhuǎn)混合物（cofactor turnover mix）時(shí)，作者觀察到產(chǎn)物的對(duì)映體選擇性降低(65:35 er)，可能是由于是FMN_sq實(shí)現(xiàn)了自由基的終止，而非FMN_hq。由于FMN_sq的N5-H鍵(59.5 kcal mol^?1)弱于FMN_hq (79.3 kcal mol^?1)，因此自由基終止應(yīng)該具有更早的過渡態(tài)，從而降低了對(duì)映選擇性。由此看來，必須添加輔助因子再生系統(tǒng)，以確保反應(yīng)在對(duì)苯二酚氧化狀態(tài)下被FMN引發(fā)。此外，為了避免外消旋的背景反應(yīng)發(fā)生，需要精確控制Ru(bpy)₃Cl₂的量(與OYE3的比例為1:1)。

（圖片來源：Nat. Catal.）

接下來，作者考察了此轉(zhuǎn)化是如何在存在明顯的外消旋背景反應(yīng)下高對(duì)映選擇性實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的（Fig. 3）。作者最初的假設(shè)是ERED通過質(zhì)子耦合電子轉(zhuǎn)移（proton-coupled electron transfer）機(jī)理實(shí)現(xiàn)底物氧化。如果是這樣的話，此反應(yīng)會(huì)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的存在而加速，因?yàn)榈谝粋€(gè)不可逆的步驟是氧化脫羧。驚訝的是，在存在和不存在蛋白質(zhì)的情況下，作者觀察到了幾乎相同的速率，這表明蛋白質(zhì)并沒有加速羧酸的氧化。Stern-Volmer淬滅研究進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)，表明N-苯基甘氨酸淬滅Ru(II)*的速率常數(shù)為K_q = 41.4 M^?1 s^?1（Fig. 3a）。當(dāng)還原的OYE3加入到相同的淬滅實(shí)驗(yàn)時(shí)，作者觀察到淬滅常數(shù)的變化可以忽略不計(jì)，由此證實(shí)該蛋白質(zhì)不會(huì)加速底物的氧化。

在排除了底物通過酶活化氧化的可能性后，作者認(rèn)為自由基的形成和C-C鍵的形成發(fā)生在溶液中，從而形成一個(gè)持久的或動(dòng)態(tài)穩(wěn)定的自由基，選擇性的在蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)終止。接下來，作者通過DFT計(jì)算得出通過自由基二聚化形成的C-C鍵的鍵能為35.4 kcal mol^?1（Fig. 3b）。雖然它比典型的C-C鍵(80 kcal mol^?1)要弱，但由于它較強(qiáng)且不能可逆地形成，因此這表明自由基的生成和C-C鍵的形成不在溶液中發(fā)生?；诖呋瘎┖偷鞍踪|(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，作者認(rèn)為自由基的形成發(fā)生在蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)。通過熒光淬滅實(shí)驗(yàn)（fluorescence-quenching experiments），作者得出酶和輔助因子之間有很強(qiáng)的聯(lián)系，這為在蛋白質(zhì)附近形成自由基提供了一種機(jī)理（Fig. 3c）?；诠獯呋瘎┖兔钢g的聯(lián)系，作者提出了可能的反應(yīng)機(jī)理（Fig. 3e）：首先，利用輔助因子周轉(zhuǎn)混合物，將ERED從FMN_ox(黃素醌，flavin quinone)還原為FMN_hq。接下來，N-苯基甘氨酸和乙烯基吡啶結(jié)合到蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)。Ru(bpy)₃²⁺通過激發(fā)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)，使羧酸氧化生成α-氨基自由基和Ru(bpy)₃¹⁺。此α-氨基自由基可以和烯基吡啶反應(yīng)得到芐基自由基，并通過氫原子轉(zhuǎn)移（HAT，hydrogen atom transfer）終止自由基（Fig. 3d）。而得到的FMN_sq可以通過電子轉(zhuǎn)移和質(zhì)子化來氧化Ru(bpy)₃¹⁺，并再生FMN_hq和Ru(bpy)₃²⁺。

（圖片來源：Nat. Catal.）

緊接著，作者對(duì)α-雜環(huán)烯烴與氨基酸的對(duì)映選擇性脫羧烷基化反應(yīng)的底物范圍進(jìn)行了探索（Fig. 4）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在吡啶環(huán)上具有鄰位、間位和對(duì)位取代基的各種一系列烯烴均可兼容，以19-90%的產(chǎn)率，良好的對(duì)映選擇性實(shí)現(xiàn)交叉偶聯(lián)產(chǎn)物3, 7-17的合成。除了2-吡啶之外，該體系還可以兼容嘧啶(18)，吡嗪(19和20)，噻唑(25和26)，3-吡啶(21)和4-吡啶(22)，以良好的收率和優(yōu)異的立體選擇性（分別高達(dá)99:1 er和2:98 er）得到所需產(chǎn)物。此外，一系列不同取代的氨基酸同樣具有良好的兼容性，以16-81%的產(chǎn)率，良好的對(duì)映選擇性得到產(chǎn)物33-43。值得注意的是，此轉(zhuǎn)化可以放大至1.0 mmol規(guī)模，在不降低對(duì)映選擇性的情況下以70%的產(chǎn)率得到產(chǎn)物(S)-3。

（圖片來源：Nat. Catal.）

最后，作者探索了此轉(zhuǎn)化的應(yīng)用性（Fig. 5）。利用8-氨基喹啉44作為起始原料，通過N-烷基化、皂化、光酶催化的脫羧烷基化等三步就可高效實(shí)現(xiàn)抗人巨細(xì)胞病毒（HCMV）化合物47的合成（41%; 91:9 er）。此外，作者利用活化烯烴48與1a通過脫羧烷基化以及隨后與EtONa反應(yīng)可以得到γ-內(nèi)酰胺50（30%; 78:22 er）。

（圖片來源：Nat. Catal.）