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2008年，Blackman等人報道了基于逆電子需求Diels-Alder（iEDDA）的四嗪（Tz）和反式-環(huán)辛烯（TCO）的生物正交反應(yīng)。該反應(yīng)中Tz分子因其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出對生物分子良好的標(biāo)記、追蹤和特異性識別能力。如Figure 1A所示，目前第一代Tz耦合熒光染料的探針體系的設(shè)計思路仍是基于F?rster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）或者跨鍵能量轉(zhuǎn)移（TBET）。然而，以上探針則表現(xiàn)出在紅光和近紅外波段重疊效果不好和FRET效率低等不足。此外，最近有文獻(xiàn)報道Dexter能量轉(zhuǎn)移策略在一定程度上能解決FRET和TBET機(jī)制帶來的問題，即能夠使紅光/近紅外發(fā)射的Tz探針的熒光增強(qiáng)（Figure 1B）。下載化學(xué)加APP到你手機(jī)，更加方便，更多收獲。

本文中，Tz探針與BODIPY熒光團(tuán)結(jié)合后得到了單發(fā)色團(tuán)型的暗態(tài)熒光探針（Figure 1C）。BODIPY-Tz探針在與BCN結(jié)合后展現(xiàn)出熒光增強(qiáng)特性，發(fā)射波長范圍為520-650 nm。作者還證明了該系列探針可用于活細(xì)胞中對不同細(xì)胞器的熒光生物成像?；贐CN和TCO的獨特結(jié)構(gòu)，BODIPY-Tz展現(xiàn)出獨特的熒光響應(yīng)特性并以此實現(xiàn)了對不同細(xì)胞器的雙色成像。

BODIPY染料具有α, β和中間位置取代位點 (Figure 2)，有關(guān)對BODIPY染料β位進(jìn)行取代的報道較少。本文中，作者對其α和β位進(jìn)行Tz分子的修飾，從而得到了BODIPY-Tz探針。基于此，作者合成了一系列BODIPY-Tz分子1-10。

接下來，作者研究了BODIPY-Tz分子的光物理性質(zhì)。所有的BODIPY-Tz分子在TCO的水溶液中沒有表現(xiàn)出熒光“開啟”的現(xiàn)象。相反，除了分子6以外其他的BODIPY-Tz化合物的熒光增強(qiáng)（Figure 3A-B）?；趩伟l(fā)色團(tuán)設(shè)計策略，所制備得到的BODIPY-Tz探針具有良好的熒光開關(guān)比，發(fā)射波長范圍覆蓋綠光到遠(yuǎn)紅外范圍（Figure 3C）。

由于S₀-S₁的光學(xué)禁阻躍遷，單發(fā)色團(tuán)型BODIPY-Tz探針的熒光被淬滅。Tz分子的非輻射能量衰減過程使得BODIPY-Tz具備有效的暗態(tài)淬滅特性。為了進(jìn)一步了解化合物的暗態(tài)淬滅效率，作者計算了BODIPY-Tz探針的振子強(qiáng)度（f）。如Figure 4A-C所示，分子的f值均小于0.005，可忽略不計，因而S₀-S₁的分子軌道躍遷主要以π→π*為主。此外，分子與BCN的結(jié)合物的能級差與理論計算的發(fā)射波長數(shù)值呈現(xiàn)線性關(guān)系（Figure 4D）。因此，理論計算結(jié)果與實驗數(shù)據(jù)一致。

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者用BODIPY-Tz探針3，4和10與商用線粒體靶向染料共染HeLa細(xì)胞。在未清洗細(xì)胞的情況下，探針3，4和10可分別實現(xiàn)綠光/紅光/遠(yuǎn)紅外通道成像（Figure 5A-C），皮爾森系數(shù)均大于0.9，共定位效果良好。同時，探針4和10的熒光強(qiáng)度更是大于商用線粒體染料（Figure 5D-E）。此外，BODIPY-Tz探針5或者10還能夠?qū)θ苊阁w分別進(jìn)行紅光和遠(yuǎn)紅外成像，具有優(yōu)秀的溶酶體靶向能力（Figure 5F-G）。

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接下來，作者對Tz和BCN之間是否發(fā)生了生物正交反應(yīng)并產(chǎn)生了具有熒光特性的BODIPY-Tz-BCN結(jié)合物進(jìn)行了驗證。Tz和TCO發(fā)生iEDDA反應(yīng)的主要產(chǎn)物含有1,4-或4,5-二氫吡啶環(huán)（Figure 6A）。從圖Figure 6B中可以看出所有BODIPY-Tz在與TCO發(fā)生iEDDA反應(yīng)后的熒光增強(qiáng)程度不明顯。最后，作者還證明了BODIPY-Tz-BCN結(jié)合物誘導(dǎo)了光致電子轉(zhuǎn)移過程（PeT）使得熒光淬滅（Figure 6C-D）。

（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

最后，作者研究了BODIPY-Tz-TCO結(jié)合物中二氫吡啶結(jié)構(gòu)對熒光淬滅的影響。從4-TCO結(jié)合物在不同溶劑中的熒光光譜可以看出（Figure 7A），隨著溶劑極性的降低，4-TCO的熒光量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度均有增加。相比于4-BCN，4-TCO在甲苯溶液中的光譜發(fā)生了移動（Figure 7B）,與實驗結(jié)果一致。以上結(jié)果表明BODIPY-Tz探針的熒光性能是源于其與BCN結(jié)合物中的吡啶基團(tuán)，而BODIPY-Tz探針與TCO的結(jié)合物中含有二氫吡啶基團(tuán)，因此在極性或者水環(huán)境中由于PeT過程而熒光減弱。當(dāng)用探針5對HeLa細(xì)胞染色后，可以得到對溶酶體和線粒體的雙色成像（Figure 7C），并且熒光信號可以被很好地區(qū)分，不存在光譜串?dāng)_的問題（Figure 7D-E）。