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Sci. Adv.：空間位阻誘導的扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移策略實現(xiàn)熒光的“開-關(guān)”
來源：化學加原創(chuàng) 2024-03-05
導讀：近日，慶應義塾大學Kenjiro Hanaoka和東京大學Yasuteru Urano等人合作，在基于空間位阻誘導的扭曲分子電荷轉(zhuǎn)移的熒光探針的設(shè)計與應用方面取得新進展，相關(guān)研究成果以“A general fluorescence off/on strategy for fluorogenic probes: Steric repulsion-induced twisted intramolecular charge transfer (sr-TICT)”為題發(fā)表在Sci. Adv.上?；跁r間相關(guān)密度泛函（TD-DFT）的理論計算數(shù)據(jù)，本文采用空間位阻誘導的扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（sr-TICT）機制設(shè)計合成了一系列具有熒光“開-關(guān)”性質(zhì)的羅丹明染料。作者將所制備的具有CYP3A4活性的探針2-Me PeER用于熒光激活細胞分類（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）技術(shù)當中。該研究為sr-TICT型熒光探針的設(shè)計提供了通用的策略。文章鏈接DOI: 10.1126/sciadv.adi8847。
熒光探針的優(yōu)點在于其高靈敏度、高選擇性和非侵入性，因而可以實現(xiàn)快速、準確地檢測。大多數(shù)具有熒光“開-關(guān)”性質(zhì)的分子設(shè)計是基于光誘導電子轉(zhuǎn)移（PeT）、F?rster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和分子內(nèi)螺旋環(huán)化，尚不能滿足熒光探針的應用需求。羅丹明是一種具有明亮發(fā)射、高光學穩(wěn)定性和水溶性的染料，作者研究了N-烷基化羅丹明染料的sr-TICT過程以探明熒光“開-關(guān)”的響應機制。在羅丹明的TICT過程中，在光激發(fā)后電荷轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在氨基（電子給體）到氧雜蒽骨架（電子受體）之間，同時伴隨著氧雜蒽骨架與N原子間（Caryl-N）單鍵的扭轉(zhuǎn)（Fig. 1A和B）。盡管N-烷基化羅丹明染料由于TCIT過程的存在而熒光淬滅，但是該染料的種類較少且Caryl-N鍵易受限制。因此，N-烷基化羅丹明染料的發(fā)光亮度適中。下載化學加APP到你手機，收獲更多商業(yè)合作機會。本文中，作者首先利用理論計算數(shù)據(jù)分析了羅丹明染料中的TICT過程，進而設(shè)計合成了一系列改進的羅丹明染料。通過結(jié)構(gòu)修飾引入分子內(nèi)扭轉(zhuǎn)基團，加速了染料分子的TICT過程從而使熒光被淬滅。最后，作者制備了具有CYP3A4活性的熒光探針并通過熒光激活細胞分類技術(shù)得到了均勻的、高功能性的人類誘導的多能干細胞衍生的肝細胞和腸上皮細胞。如Fig. 1C和D所示，激發(fā)態(tài)的羅丹明染料在j = 50° ~ 60°時具有旋轉(zhuǎn)勢壘。Azetidinyl-羅丹明染料的旋轉(zhuǎn)勢壘要比四甲基羅丹明（TMR）要高，因此前者的TICT態(tài)相比于LE態(tài)更不穩(wěn)定。以上結(jié)果表明Azetidinyl-羅丹明染料中較高的勢壘和TICT態(tài)的不穩(wěn)定性抑制了TICT過程，進而使染料的亮度增強?；诶碚撚嬎銛?shù)據(jù)，作者通過增強TICT的途徑發(fā)展了非熒光羅丹明染料。作者認為降低LE態(tài)到TICT態(tài)的旋轉(zhuǎn)勢壘同時穩(wěn)定TICT態(tài)可以加速TICT態(tài)的形成。因此，假設(shè)在羅丹明染料中的二烷基胺基的鄰位引入“體積大”的基團可以使分子的空間位阻增大，打破分子的平面性，加速TICT態(tài)的形成（Fig. 1E）。為了驗證該策略的有效性，作者設(shè)計了探針2-Me TMR并計算了Caryl-N鍵的旋轉(zhuǎn)角度對總能量的依賴關(guān)系（Fig. 1F）。
Figure 1. 羅丹明染料TICT過程的理論計算和基于TICT機制的羅丹明非熒光染料的分子設(shè)計
接下來，作者設(shè)計合成了2-Me TMR染料并分析其光學穩(wěn)定性。盡管2-Me TMR與TMR染料的吸收光譜相似（Fig. 2A和B），但是前者的熒光量子產(chǎn)率顯著降低。如Fig. 2C所示，隨著溶液體系粘度的增加，分子的熒光量子產(chǎn)率也隨之增加。此外，由于溶劑的極性會影響分子的TICT過程，2-Me TMR在低極性溶劑中具有更高的熒光量子產(chǎn)率。以上結(jié)果表明由于空間位阻基團的引入，染料2-Me TMR表現(xiàn)出TICT特征。為了驗證位阻基團的“尺寸”對TICT過程的影響，作者合成了含F(xiàn)和Cl原子的羅丹明染料衍生物。由于F原子的“尺寸”較小，sr-TICT過程的發(fā)生相對較容易，從而展現(xiàn)出較高的熒光量子產(chǎn)率（Fig. 2D和E）。同時，2-F TMR和2-Cl TMR染料的旋轉(zhuǎn)勢壘要比TMR小，TICT態(tài)相比于LE態(tài)也更加穩(wěn)定（Fig. 2F）。
Figure 2. 基于sr-TICT機制的羅丹明非熒光染料的分子設(shè)計（圖片來源：Sci. Adv.）
為了研究雜蒽骨架上氨基取代基對sr-TICT過程的影響，作者合成了2-Me TMR 和2-Cl TMR（Fig. 3A和B）。N-去甲基衍生物的熒光量子產(chǎn)率相比于未取代染料的熒光量子產(chǎn)率要高。以上結(jié)果表明sr-TICT的熒光淬滅效率可以通過調(diào)控氨基取代基實現(xiàn)。理論計算和熒光量子產(chǎn)率-旋轉(zhuǎn)勢壘數(shù)據(jù)均證明羅丹明染料的TICT態(tài)與旋轉(zhuǎn)勢能Ea和LE態(tài)的ΔH有關(guān)（Fig. 3C和D）。
Figure 3. 氨基取代基對sr-TICT過程的影響以及基于sr-TICT機制的羅丹明染料的TD-DFT計算
作者利用染料對細胞色素P450 3A4（CYP3A4）的N-脫烷基化過程得到了具有熒光“開-關(guān)”性質(zhì)的探針（Fig. 4A）。在加入CYP3A4后，2-Me HER顯示出特異性的熒光增強現(xiàn)象（Fig. 4B）。此外，作者發(fā)現(xiàn)增加烷基的鏈長還能夠提升染料對CYP3A4的反應活性。最后，2-Me PeER在PBS緩沖液中的低蛋白含量條件下對CYP3A4具有很高的反應活性和較低的熒光量子產(chǎn)率（Fig. 4C和D）。同時，2-Me PeER對CYP3A4也表現(xiàn)出明顯的熒光增強性質(zhì)和高選擇性（Fig. 4E）。此外，2-Me PeER還展示出對人肝微粒體（HLM）的熒光增強特征（Fig. 4F）。
Figure 4. CYP3A4和2-Me PeER活性熒光探針的設(shè)計及體外實驗（圖片來源：Sci. Adv.）
在細胞實驗中，2-Me PeER在活細胞中可以對CYP3A4進行熒光成像（Fig. 5A-C）。同時，2-Me PeER 還能夠?qū)epaRG細胞進行明亮的熒光成像（Fig. 5D和F）。2-Me PeER主要被類肝細胞代謝并保留在細胞內(nèi)，該性質(zhì)有利于使2-Me PeER能夠在復雜的培養(yǎng)條件下評價細胞的CYP3A4的活性，有望被用于熒光激活細胞分類術(shù)中。
Figure 5. 2-Me PeER活性熒光探針的活細胞成像
最后，利用熒光激活細胞分類技術(shù)，作者還成功驗證了2-Me PeER可對多能干細胞來源的肝樣細胞和腸道上皮細胞進行分類篩選（Fig. 6）。
Figure 6. 2-Me PeER活性熒光探針的細胞實驗
（圖片來源：Sci. Adv.）
慶應義塾大學Kenjiro Hanaoka和東京大學Yasuteru Urano等人通過理論計算數(shù)據(jù)分析了羅丹明染料中的TICT過程，從而利用空間位阻策略加速了TICT過程，實現(xiàn)了對熒光強度的調(diào)控。為了驗證策略的有效性，作者驗證了2-Me PeER探針在體外實驗中可以高靈敏度地檢測CYP3A4，表現(xiàn)出在藥物篩選方面的巨大應用潛力。文獻詳情：
Kenjiro Hanaoka*, Takayuki Ikeno, Shimpei Iwaki, Sayaka Deguchi, Kazuo Takayama, Hiroyuki Mizuguchi, Fumiya Tao, Nobuhiko Kojima, Hisashi Ohno, Eita Sasaki, Toru Komatsu, Tasuku Ueno, Kazuya Maeda, Hiroyuki Kusuhara, Yasuteru Urano*. A general fluorescence off/on strategy for fluorogenic probes: Steric repulsion-induced twisted intramolecular charge transfer (sr-TICT). Sci. Adv.2024，https://doi.org/10.1126/sciadv.adi8847
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