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Alkylidene環(huán)丙烷是一類天然的和合成的張力環(huán)化合物（Figure 1a），其烯烴部分可以發(fā)生轉(zhuǎn)化，且取代基之間具有不尋常的立體化學(xué)和幾何關(guān)系。單取代的聯(lián)烯與非對稱卡賓的環(huán)丙烷化可以產(chǎn)生八種異構(gòu)體產(chǎn)物（Figure 1b），并且由于聯(lián)烯的特性使得它們的立體選擇性環(huán)丙烷化具有很大的挑戰(zhàn)。首先，由于中心缺電子的sp碳降低了聯(lián)烯的親核性，因此聯(lián)烯在環(huán)丙烷化反應(yīng)中比烯烴的反應(yīng)性差；其次，與末端聯(lián)烯中的端位烯烴反應(yīng)在空間上是有利的，而與內(nèi)部烯烴反應(yīng)在電性上有利；再次，1,1-二取代非對稱聯(lián)烯中的端位烯烴的兩個面是非對映異構(gòu)的，從而導(dǎo)致產(chǎn)物的不同(E)-和(Z)-構(gòu)型。因此，盡管ACPs的立體化學(xué)研究已有豐富的歷史，但目前僅報道了5例ee > 90%的非手性聯(lián)烯的對映選擇性環(huán)丙化反應(yīng)，且這5例是通過使用空間位阻較大的卡賓或含有第二個結(jié)合位點(diǎn)的金屬和過量的聯(lián)烯來克服上述挑戰(zhàn)的（Figure 1c）。由于很少有聯(lián)烯是商業(yè)可得的，因此對有限的聯(lián)烯實(shí)現(xiàn)選擇性環(huán)丙烷化反應(yīng)具有重要意義。然而，通過聯(lián)烯的分子間對映選擇性環(huán)丙化形成(Z)-異構(gòu)體主要產(chǎn)物到目前還是未知的。最近，美國加州大學(xué)伯克利分校John F. Hartwig課題組報道了一個通過定向進(jìn)化的Ir(Me)-CYP119變體催化聯(lián)烯與EDA的區(qū)域選擇性環(huán)丙烷化，形成了具有優(yōu)異對映選擇性的(E)-或(Z)-異構(gòu)體（Figure 1d）。下載化學(xué)加APP到你手機(jī)，收獲更多商業(yè)合作機(jī)會。

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

首先，作者以苯基聯(lián)烯和EDA作為模板底物對反應(yīng)進(jìn)行探索（Figure 2）。通過對酶活性位點(diǎn)的8個位置（V151, A152, L205, I208, A209, G213, P253, L354）進(jìn)行篩選（Figure 2a），得到的最佳反應(yīng)條件為：EDA (50 mM)，E . coli harboring, CYP_variant (4 uM [Ir]), M9-N緩沖液，室溫反應(yīng)6小時。且當(dāng)使用CYP_E?plus可以以> 99%的ee得到E-(?)-ACP異構(gòu)體。此外，使用純化的CYP_E?plus酶在1 mmol的規(guī)模上制備E-(?)-ACP時，產(chǎn)率為69% (909 TON)，ee值為97%，且1a/1b/1c的比例為97:1:2。并且E-(?)-ACP異構(gòu)體通過X-射線晶體學(xué)測定得出其為(R)-對映體（Figure 2b）。

接下來，作者還通過靶向活性位點(diǎn)的四個額外位點(diǎn)來尋找能夠形成(Z)-異構(gòu)體的突變體（Figure 3）。當(dāng)使用CYP_Z?minus時，可以以高達(dá)94%的ee, 28:72 E/Z得到Z式異構(gòu)體產(chǎn)物。

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

在確定了突變體可以對(E)-(+)、(E)-(?)和(Z)-(?)立體異構(gòu)體進(jìn)行選擇性識別后，作者研究了聯(lián)烯取代基對立體選擇性的影響（Figure 4）。CYP_E?plus對芳基-ACPs中芳基上的小位阻取代基如氟、甲基、甲氧基和氯具有良好的耐受性(97% ~ 99% ee)。而芳基上位阻較大的取代基如正丙基、溴和叔丁基會使ee值有小幅度的降低(分別為96% ee、92% ee和87% ee)。此外，具有更柔性的正己基和苯乙基的脂肪族ACPs也可以以良好的對映選擇性形成環(huán)丙烷。

為了評估控制立體選擇性的因素，作者進(jìn)行了DFT計算和MD（molecular dynamics）模擬（Figure 5）。首先，作者對游離的、非取代的Ir(Me)-卟啉絡(luò)合物催化聯(lián)烯1的反應(yīng)進(jìn)行了DFT計算，揭示了輔助因子對苯基聯(lián)烯環(huán)丙烷化的內(nèi)在選擇性。DFT計算表明端位雙鍵和內(nèi)部雙鍵通過環(huán)丙烷化形成的E-或Z-異構(gòu)體的過渡態(tài)能量均在1 kcal·mol^?1左右。最低能量過渡態(tài)（ΔG^?為4.6 kcal·mol^?1）導(dǎo)致(E)-ACP產(chǎn)物的生成，且其為主要的烯烴異構(gòu)體，但由于計算所得到的ΔG^?差異很小，由此表明進(jìn)化的酶的選擇性主要由與活性位點(diǎn)氨基酸側(cè)鏈的相互作用所控制。由于這些模型的ΔG^?值較低(4.6-5.7 kcal·mol^?1)，因此反映了Ir-卡賓中間體對聯(lián)烯的高反應(yīng)活性。接下來，作者通過MD模擬表明，在CYP_{E - plus}變體中，由于Gly在213位被Leu取代，卡賓在Ir-C鍵周圍旋轉(zhuǎn)了大約100^o。此外，結(jié)合聯(lián)烯的MD模擬表明，末端烯烴以一種類似于DFT優(yōu)化的(E)-(?)-ACP-TS構(gòu)象接近CYP_Z?minus活性位點(diǎn)的卡賓。

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）