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將酶催化和過渡金屬催化結(jié)合在人工金屬酶內(nèi)可以有效拓展自然界中的未知化學(xué)轉(zhuǎn)化。其可以通過在蛋白質(zhì)活性位點內(nèi)對反應(yīng)催化中心進(jìn)行識別，從而通過蛋白質(zhì)工程在實現(xiàn)協(xié)同催化的同時得到良好的選擇性，因此有效解決了不對稱有機(jī)金屬催化中的幾個關(guān)鍵問題。鏈霉親和素是一種同源四聚體蛋白質(zhì)，其可以與生物素化的金屬絡(luò)合物結(jié)合在一起作為人工金屬酶應(yīng)用在多種非天然轉(zhuǎn)化中。然而到目前為止使用基于鏈霉親和素的人工金屬酶來對映選擇性的合成異吲哚酮仍未實現(xiàn)。最近，印度理工學(xué)院孟買校區(qū)Prasenjit Bhaumik課題組和Debabrata Maiti課題組發(fā)展了鏈霉親和素-生物素-銠(III)催化體系，使用N-(特戊酰氧基)苯甲酰胺和芳香重氮酯為起始原料，以高達(dá)95:5的對映體比例實現(xiàn)了手性異吲哚酮的合成（Fig. 1）。化學(xué)加——科學(xué)家創(chuàng)業(yè)合伙人，歡迎下載化學(xué)加APP關(guān)注。

（圖片來源：Nat. Synth.）

首先，作者選擇N-(特戊酰氧基)苯甲酰胺1a和芳香重氮酯2a作為模板底物對反應(yīng)條件進(jìn)行了探索（Table 1）。通過對一系列酶突變體進(jìn)行篩選，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用1a (0.01 mmol), 2a (0.015 mmol), Sav S112Y/K121E mutant (0.66 mol%, 4.3 mg), [RhCp*biotinCl₂]₂ (1 mol%), MOPS緩沖液(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) (1 M, pH 6.0) 162 μl, 丙酮 54 μl, 23 °C反應(yīng)72小時可以以22%的產(chǎn)率，81：19 e.r.得到手性異吲哚酮3a。突變體S112Y/K121E中酪氨酸和谷氨酸的協(xié)同作用對于反應(yīng)的對映選擇性至關(guān)重要。值得注意的是，單獨使用[RhCp*Cl₂]₂和[RhCp*biotinCl₂]₂在醋酸鹽緩沖溶液中催化是無法形成3a的。

（圖片來源：Nat. Synth.）

在得到了最優(yōu)反應(yīng)條件后，作者對此轉(zhuǎn)化的底物范圍進(jìn)行了考察（Fig. 2）。實驗結(jié)果表明，不同取代的N-(特戊酰氧基)苯甲酰胺和芳香重氮酯均具有良好的兼容性，以8-72%的產(chǎn)率，良好的對映選擇性得到相應(yīng)的手性異吲哚酮產(chǎn)物3a-3y。其中包括硝基、鹵素、烷氧基和烷基等不同基團(tuán)均可兼容。此外，作者通過X射線單晶衍射和HPLC分離證實了產(chǎn)物3e的絕對構(gòu)型為R構(gòu)型，這主要是由于S112Y/K121E的使用。通常來講，苯甲酰胺的對位連有給電子基團(tuán)（甲基，甲氧基等）時選擇性相對較低。此外，在芳基重氮酯的對位連有Cl和^tBu時產(chǎn)率相對較高。

（圖片來源：Nat. Synth.）

接下來，作者對一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的芳基重氮酯的兼容性進(jìn)行了考察（Fig. 3）。實驗結(jié)果表明，包括3號位含有芳基硫、芳基胺、芳基硒和芳基乙炔以及4號位含有甲基、甲氧基、苯基、乙烯基以及硝基等取代的芳基重氮酯均可順利實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，以合成有用的產(chǎn)率（8-67%）和中等的對映選擇性得到相應(yīng)的產(chǎn)物3aa-3bd。此外，將催化劑的量提升至3?mol%時，產(chǎn)物的產(chǎn)率可以增加兩倍以上，而對映選擇性幾乎保持不變。

（圖片來源：Nat. Synth.）

由于作者從[RhCp*biotinCl₂]₂:Sav S112Y/K121E絡(luò)合物的高分辨晶體結(jié)構(gòu)中觀察到殘基45-52非常接近反應(yīng)中心，并在反應(yīng)過程中大概率可以影響底物的靠進(jìn)，從而影響反應(yīng)的對映選擇性結(jié)果。特別是距離輔因子5??（N_CB到Cp*）的N49殘基。因此作者對WT和S112Y/K121E骨架的N49殘基進(jìn)行突變得到了六個單突變體、五個三突變體和一個雙突變體。其中，單突變體 N49V、N49I和N49Y和雙突變體N49F/K121E與S112Y/K121E相比逆轉(zhuǎn)了對映選擇性，得到(S)-3aa為主要的立體異構(gòu)體。此外，對于3s和3as來講，N49Y比N49F/K121E更有效。而在所有其它情況下，突變體N49F/K121E傾向于相反的立體選擇性（3a、3aa-3aq和3au）。上述結(jié)果均表明N49殘基可以決定與重氮酯反應(yīng)的面選擇性（Fig. 4）。

（圖片來源：Nat. Synth.）

為了探索反應(yīng)中的C-H活化過程的可逆性，作者以芳環(huán)被氘代的N-(特戊酰氧基)苯甲酰胺底物，在不存在重氮突變體的條件下，使用S112Y/K121E和N49Y在最優(yōu)反應(yīng)條件下反應(yīng)48小時后并未在鄰位觀察到氫原子的引入。由此表明C-H活化步驟是不可逆的，這與之前的有機(jī)金屬催化過程相一致（Fig. 5a）。

基于上述實驗結(jié)果，作者提出了此轉(zhuǎn)化可能的反應(yīng)機(jī)理（Fig. 5b）：首先，輔因子（中間體I）中的Rh(III)與酰胺的氮原子相互作用得到中間體II；隨后通過協(xié)同金屬化-去質(zhì)子化進(jìn)行C-H活化得到五元環(huán)銠中間體III并與重氮酯反應(yīng)形成中間體IV；接下來，通過決定對映選擇性的遷移插入得到六元環(huán)銠中間體V，并經(jīng)歷還原消除得到產(chǎn)物3a和Rh(I)。而Rh(I)可以被N-O鍵氧化為Rh(III)，并通過質(zhì)子去金屬化過程促進(jìn)活性催化中間體I的再生來完成催化循環(huán)。

（圖片來源：Nat. Synth.）