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研究者們首先確定了經(jīng)過四個(gè)月的卡路里限制的小鼠，其體內(nèi)的AMPK被充分激活（圖1，下，以肌肉為例），這與AMPK在卡路里限制時(shí)起到的關(guān)鍵作用相符。然而，研究者們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在此時(shí)，小鼠卻并沒有發(fā)生“低血糖”，也就是血糖并未下降到先前他們發(fā)現(xiàn)的、足以激活A(yù)MPK的程度（5 mM以下）：與正常飲食的小鼠在饑餓8小時(shí)血糖就降低到4 mM（圖1，左上）相比，卡路里限制小鼠的血糖至少在5.5 mM（圖1，右上），這說明卡路里限制所導(dǎo)致的AMPK激活并不因?yàn)榻档推咸烟撬?。研究者們于是嘗試將卡路里限制小鼠的血清添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，的確發(fā)現(xiàn)即使在高糖（25 mM）的DMEM中，AMPK仍舊能被激活（圖2），這說明卡路里限制對(duì)AMPK激活的信號(hào)存在于血清中。研究者們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血清透析，去除其中的小分子代謝物，抑制了其對(duì)AMPK的激活；而熱滅活血清，去除其中的蛋白則無此作用，這說明了卡路里限制后的血清通過其中的小分子激活了AMPK。

圖1. 卡路里限制與饑餓對(duì)小鼠血糖和肌肉AMPK激活的效果對(duì)比

圖2. 卡路里限制后的小鼠血清可以激活高糖培養(yǎng)的細(xì)胞中的AMPK

研究者們于是進(jìn)一步利用多種質(zhì)譜方法（包括液相色譜-質(zhì)譜，氣相色譜-質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用等），尋找卡路里限制后血清中發(fā)生顯著變化的小分子代謝物。發(fā)現(xiàn)在他們能測(cè)得的代謝物中，卡路里限制影響了超過一半的代謝物水平（695個(gè)，包括341個(gè)極性代謝物和354個(gè)脂類），這也和傳統(tǒng)的“飲食決定代謝”的觀點(diǎn)吻合。研究者于是繼續(xù)探究是哪些化合物影響了AMPK的激活。他們首先去除了血清中的脂質(zhì)，發(fā)現(xiàn)仍能引起AMPK的激活，于是他們就把重點(diǎn)放在剩下的341個(gè)極性代謝物中。在這些代謝物中，有212個(gè)水平升高和129個(gè)降低：對(duì)于升高的代謝物，他們將其直接添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中，觀察其是否能夠直接激活A(yù)MPK；而對(duì)于含量降低的代謝物，他們則假設(shè)這些代謝物起到了抑制AMPK的作用（在卡路里限制后，這種抑制作用就被解除）——于是將其添加到了已被卡路里限制的血清激活了AMPK的細(xì)胞的培養(yǎng)基中，觀察其是否能夠反過來抑制AMPK的激活。他們也設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)所用的代謝物的濃度：對(duì)于已報(bào)道了生理濃度的，直接結(jié)合卡路里限制后的變化進(jìn)行選擇；未報(bào)導(dǎo)生理濃度的，則統(tǒng)一選擇10 mM作為最高濃度，以此為基準(zhǔn)進(jìn)行下調(diào)，就此設(shè)定濃度梯度。經(jīng)過逐個(gè)篩選，他們鑒定出了6個(gè)代謝物能夠激活A(yù)MPK，而這其中，只有石膽酸能夠在符合卡路里限制后的濃度下（血清中穩(wěn)定在1 μM左右，且不隨著進(jìn)食等條件發(fā)生變化；圖3，左），激活A(yù)MPK（圖3，右），而直接對(duì)小鼠，以及線蟲、果蠅等其它模式動(dòng)物喂食石膽酸后，也能觀察到其體內(nèi)的AMPK被激活。

圖3. 卡路里限制小鼠血清中石膽酸含量（左）以及該濃度下石膽酸對(duì)AMPK的激活（右）

研究者們于是進(jìn)一步在線蟲、果蠅和小鼠中驗(yàn)證石膽酸是否能模擬卡路里限制的抗衰和延壽效果。通過喂食石膽酸，他們發(fā)現(xiàn)線蟲和果蠅的壽命顯著增加，而且抗氧化應(yīng)激能力和極端環(huán)境下的生存能力（抗逆性）也得到顯著的提升（圖4）。對(duì)于老年小鼠，發(fā)現(xiàn)石膽酸喂食一個(gè)月后，可以提升其抓握力和跑步能力（圖5），同時(shí)其肌肉的損傷修復(fù)能力也明顯提升，這表明石膽酸有促進(jìn)小鼠肌肉的年輕化的作用。進(jìn)一步地，在AMPK敲除或敲低的線蟲和果蠅（分別為aak-2的線蟲和Act5C-GAL4-AMPKα RNAi的果蠅；圖4），以及AMPK肌肉特異性敲除的老年小鼠（圖5；α-MKO）中，就觀察不到石膽酸的上述作用，這說明石膽酸是通過激活A(yù)MPK，模擬了卡路里限制的有益作用。有意思的是，作為一種次級(jí)膽酸，石膽酸是由肝臟合成的初級(jí)膽酸分泌到腸道后，由腸道微生物轉(zhuǎn)化而來；而至少目前，這樣的轉(zhuǎn)化機(jī)制在線蟲和果蠅體中還未被發(fā)現(xiàn)。然而即便如此，石膽酸仍能在線蟲和果蠅中激活A(yù)MPK并延壽，這說明上述動(dòng)物中有一條保守的AMPK激活通路，維持了健康長(zhǎng)壽的有益效果。

圖4.石膽酸通過AMPK延長(zhǎng)線蟲（a）和果蠅（b）的壽命

圖5. 石膽酸通過AMPK增加老年小鼠的握力（上）和跑步能力（下）

圖6. 細(xì)胞中引入V1E1的突變對(duì)AMPK的激活效果

在此基礎(chǔ)上，研究者們進(jìn)一步探索石膽酸是如何引起V1E1的去乙酰化的。已知體內(nèi)去乙?；钢饕怯蓛纱蠹易寮碨IRTs （sirtuins）家族（有SIRT1到SIRT7七個(gè)成員）和HDACs家族（HDAC1到HDAC11）組成，而在細(xì)胞中表達(dá)任意一個(gè)SIRT——尤其是SIRT1，即可以直接激活A(yù)MPK。相比較之下，HDACs家族蛋白的表達(dá)則無此現(xiàn)象。需要注意的是，SIRTs家族的蛋白之間有較強(qiáng)的redundancy，例如敲除SIRT1，其功能會(huì)被其它SIRTs所彌補(bǔ)，因此在細(xì)胞中敲除單個(gè)SIRT，并不能完全阻斷石膽酸對(duì)AMPK的激活。研究者們于是將7個(gè)SIRT家族蛋白全部敲除，終于檢測(cè)到了對(duì)石膽酸所引起的V1E1的去乙?；约皩?duì)AMPK的激活的完全阻斷。作為對(duì)照，研究者們還檢測(cè)了石膽酸對(duì)另一個(gè)SIRTs（SIRT1、SIRT2和SIRT6）的經(jīng)典底物——組蛋白H3的K9位點(diǎn)的乙?；?(12-14)，結(jié)果也表明，石膽酸促進(jìn)了H3-K9的去乙?；?。因此，石膽酸是通過促進(jìn)SIRTs的活力，使其去乙?；疺1E1并抑制v-ATPase的活力，從而啟動(dòng)溶酶體途徑并激活A(yù)MPK。

然而，當(dāng)研究者們?cè)噲D進(jìn)一步在體外重構(gòu)上述石膽酸促進(jìn)SIRTs活力的過程時(shí)，卻遇到了困難：他們發(fā)現(xiàn)，盡管原核表達(dá)的SIRT1的確能夠在體外去乙?；铣傻腣1E1多肽，但石膽酸卻不能促進(jìn)這一過程（圖7，左）。這和體內(nèi)得到的結(jié)論完全不同，也讓研究者們陷入了困境——難道是上述的篩選過程出錯(cuò)了嗎？于是，他們把體外系統(tǒng)中的每種成分一步步地“替換”成近似于細(xì)胞內(nèi)的成分，最終發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用從細(xì)胞中純化（免疫沉淀）所得到的SIRT1代替原核表達(dá)的SIRT1，或者讓原核表達(dá)的SIRT1先和細(xì)胞裂解液孵育，再加進(jìn)體外系統(tǒng)中，就能夠觀察到石膽酸對(duì)SIRT1活力的提升了（圖7，右）！這意味著SIRT1在體內(nèi)天然存在著一個(gè)“伙伴”：由它來結(jié)合石膽酸，再反過來導(dǎo)致SIRT1的激活；而原核表達(dá)的SIRT1沒有這個(gè)“伙伴”的結(jié)合，自然也就不能響應(yīng)石膽酸的調(diào)節(jié)。

圖7. 石膽酸對(duì)原核表達(dá)SIRT1蛋白（左）以及與細(xì)胞裂解液孵育后的、原核表達(dá)的SIRT1蛋白（右）的去乙?；盍τ绊?/p>

圖8. TULP3敲除阻止了石膽酸對(duì)AMPK的激活（左），且回補(bǔ)不結(jié)合石膽酸的突變體（TULP3-4G）無法恢復(fù)石膽酸對(duì)AMPK的激活（右）

圖9. 石膽酸對(duì)老年小鼠抓握力（上）和跑步能力（下）的提高依賴于TULP3

綜上，林圣彩院士團(tuán)隊(duì)鑒定了一個(gè)卡路里限制的模擬物——石膽酸，并解析了石膽酸通過TULP3-sirtuin-v-ATPase-AMPK軸發(fā)揮延壽效果的具體機(jī)制（圖9，右），這一發(fā)現(xiàn)補(bǔ)全了機(jī)體感知卡路里限制引起的代謝信號(hào)并發(fā)揮延緩衰老作用的空白。石膽酸是否可以作為新的長(zhǎng)壽藥物將進(jìn)行進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。同時(shí)，對(duì)于石膽酸延壽機(jī)理的解析也為開發(fā)新的長(zhǎng)壽藥物提供了新的理論和靶點(diǎn)。

回顧起來，林圣彩院士感嘆，他的團(tuán)隊(duì)從發(fā)現(xiàn)（低）葡萄糖感知通路是延長(zhǎng)壽命的核心軸 (8-10, 15)，到發(fā)現(xiàn)該通路除了能感知餐前正常的葡萄糖下降，也介導(dǎo)了二甲雙胍的有益功能（圖10，左），再到現(xiàn)在加上了卡路里限制的模擬物也就是石膽酸的“借道”（圖10，右），他越發(fā)覺得AMPK的溶酶體通路是高等生物中的固有的通路，也很可能因?yàn)檫@樣重要的生理功能，而在進(jìn)化上被保留下來。可以說，這是大自然賜予生命的不僅能抵抗饑餓，還能從饑餓中獲得益處的“賦能”。

圖10. 溶酶體通路全景圖

這兩篇文章的第一研究者瞿琦是廈門大學(xué)2014級(jí)本科生，于2018年留校攻讀碩士，并在2019年轉(zhuǎn)博至今。據(jù)林圣彩院士介紹，瞿琦是在2016年，通過廈門大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃”進(jìn)入他的實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)的，從那時(shí)起，他就參與了這個(gè)工作，為石膽酸及其靶點(diǎn)和機(jī)制的鑒定付出了八年半的辛勤努力；尤其是在發(fā)現(xiàn)石膽酸并不能直接促進(jìn)SIRT1的活力，還需要重新尋找其靶點(diǎn)的時(shí)候，他沒有氣餒，而是心無旁騖地又付出了三年半的時(shí)間，最終完成了整個(gè)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，也深深地鼓舞了團(tuán)隊(duì)的所有人。兩篇文章的共同第一研究者陳艷和王鈺則分別鑒定出了石膽酸及其通路在果蠅、小鼠和線蟲中的功能，而第二篇文章的共同第一研究者王維澈則承擔(dān)了SIRTs的相互作用蛋白的篩選和鑒定，他們和林圣彩院士團(tuán)隊(duì)的其它成員一起，都為該工作的研究做出了不可替代的貢獻(xiàn)。

此外，大連化物所樸海龍研究員和遺傳與發(fā)育所稅光厚教授指導(dǎo)了本文的代謝物鑒定，北京大學(xué)姜長(zhǎng)濤教授和廈門大學(xué)郭浩教授指導(dǎo)、分析了腸道菌群對(duì)石膽酸的產(chǎn)生影響，廈門大學(xué)俞勇教授、北京大學(xué)劉穎教授和廈門大學(xué)劉波教授、鄭燚明教授分別指導(dǎo)了線蟲和果蠅的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，廈門大學(xué)鄧賢明教授指導(dǎo)了石膽酸制劑的制作與使用，廈門大學(xué)田華雨教授和陳穎教授指導(dǎo)、協(xié)助了多個(gè)敲入細(xì)胞系的構(gòu)建，廈門大學(xué)分析測(cè)試中心的多位技術(shù)人員承擔(dān)了本研究的代謝物和蛋白質(zhì)譜鑒定工作，廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心則提供、構(gòu)建了本研究所用到的小鼠品系。