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雜萜天然產(chǎn)物是一類結(jié)構(gòu)多樣、生物活性廣泛的復(fù)雜天然產(chǎn)物，目前已發(fā)現(xiàn)超過500個化合物（圖1A）。其中，pyripyropene C對?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（ACAT）表現(xiàn)出強效的抑制活性（IC₅₀為53 nM），zonarol (1)具有神經(jīng)保護作用，ent-(+)-chromazonarol (2)是一個針對農(nóng)作物病原菌的潛在防治藥物，mycoleptodiscin A (3)表現(xiàn)出中等的抗菌活性，而pelorol (4)對真菌表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制活性（EC₅₀為7.7 μM）。這些化合物均以drimane骨架（藍(lán)色標(biāo)注部分）與非萜類部分形成獨特的雜合結(jié)構(gòu)，在藥物開發(fā)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面展現(xiàn)出良好的開發(fā)潛力，然而其高效合成一直是一個重要挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的雜萜天然產(chǎn)物合成策略主要依賴兩種方法（圖1B）：立體選擇性多環(huán)化和手性合成子法。立體選擇性多環(huán)化方法往往步驟冗長，且在關(guān)鍵的生物模擬環(huán)化步驟中立體選擇性難以控制。而手性合成子法雖然立體化學(xué)明確，但主要依賴植物來源的香紫蘇內(nèi)酯或香紫蘇醇作為起始原料，需要3-6步的側(cè)鏈降解反應(yīng)才能獲得目標(biāo)C₁₅中間體，這不僅降低了原子經(jīng)濟性，也影響了整體合成效率。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)drimenol (5)和albicanol (6)這類drimane型化合物可以作為替代性手性砌塊，它們能夠與芳基鹵代物直接偶聯(lián)，無需碳鏈降解過程，為雜萜天然產(chǎn)物提供了更為簡潔的合成途徑。然而，這些C₁₅化合物在自然界中含量極其有限，且以往報道的異源生產(chǎn)方法產(chǎn)量普遍較低，例如在煙草葉片中表達(dá)PhDS基因獲得的drimenol產(chǎn)量僅為392 μg/g鮮重，而在酵母中生產(chǎn)albicanol需要4L培養(yǎng)基和96小時發(fā)酵才能獲得8.3 mg產(chǎn)物。這種低效的生產(chǎn)方式嚴(yán)重限制其作為手性砌塊的進一步開發(fā)。

面對這一關(guān)鍵瓶頸問題，研究團隊開發(fā)了綜合的微生物工程策略（圖1C）。該策略首先利用“人工兩步法”PhoN-IPK系統(tǒng)來提供萜類前體，這一系統(tǒng)可以將外源添加的五碳醇DMAA/ISO直接轉(zhuǎn)化為五碳焦磷酸前體IPP和DMAPP，顯著簡化了傳統(tǒng)MVA或MEP途徑（圖1C）。在此基礎(chǔ)上，團隊通過兩個關(guān)鍵策略來提升目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量：策略1引入生物合成通路中Nudix水解酶從而提高產(chǎn)物滴度；策略2則通過對PhoN-IPK系統(tǒng)中關(guān)鍵磷酸化酶PhoN進行理性設(shè)計和改造從而提高底物轉(zhuǎn)化效率。

在初始階段，研究團隊首先對drimenol合酶進行篩選（圖2A）。通過對比SsDMS、ScDMS和CavC三個來源不同的drimenol合酶，發(fā)現(xiàn)它們的產(chǎn)量差異并不顯著（13-15 mg/L）。由于II型萜類環(huán)化酶產(chǎn)生的中間產(chǎn)物帶有焦磷酸基團，研究人員猜測大腸桿菌內(nèi)源水解酶的低效率可能是限制產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。進一步對drimenol生物合成基因簇分析發(fā)現(xiàn)，SsDMS上游存在Nudix水解酶（SsNDH）。經(jīng)實驗證實，引入SsNDH后產(chǎn)量顯著提升至63 mg/L。

為了進一步優(yōu)化催化效率，團隊設(shè)計了不同的酶表達(dá)方式（圖2B）?？紤]到空間鄰近性可能有助于底物傳遞，研究人員構(gòu)建了SsNDH-SsDMS融合蛋白。通過AlphaFold2預(yù)測的結(jié)構(gòu)顯示，兩個酶的活性位點可以通過柔性linker連接實現(xiàn)良好的空間布局。在對linker長度進行優(yōu)化后（圖2C），產(chǎn)量進一步提升至111 mg/L。預(yù)測的融合蛋白結(jié)構(gòu)（圖2D）清晰地展示了SsNDH（粉色）和SsDMS（橙色）通過柔性linker（藍(lán)色）形成的空間排布。

盡管通過融合蛋白策略顯著提升了產(chǎn)量，但111 mg/L的產(chǎn)量仍難以滿足實際應(yīng)用需求。團隊注意到在整個反應(yīng)過程中，PhoN催化的可逆磷酸化和水解反應(yīng)可能是另一個關(guān)鍵的限速步驟。通過結(jié)構(gòu)分析（圖3A）發(fā)現(xiàn)，PhoN的活性位點由K133、R140、S166、G167、H168、R201、H207和D211等殘基組成。對這些位點進行丙氨酸掃描發(fā)現(xiàn)突變后產(chǎn)物幾乎完全喪失（圖3B），證實了這些位點的重要性。

基于PhoN催化可逆磷酸化反應(yīng)的特點，研究團隊提出了一個提高催化效率的新思路：通過在活性口袋附近引入正電荷，增強酶與磷酸基團的相互作用。通過對DMAP和PhoN的分子對接實驗，團隊選擇了位于配體4?范圍內(nèi)的E122、G125、L158和I171進行定點突變。結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示（圖3C），在不同位點引入精氨酸或賴氨酸會產(chǎn)生不同的效果：E122R/K突變在底物進入的關(guān)鍵位置顯著增加了正電荷，而G125R/K突變雖然增加了電荷但可能會阻礙活性口袋，L158和I171作為內(nèi)部殘基，帶電突變對口袋表面電荷的影響較小。隨后的實驗結(jié)果完全符合這一預(yù)測：E122R突變使產(chǎn)量提升至178 mg/L（提高1.6倍），而G125R/K變體產(chǎn)量嚴(yán)重下降（分別為17和9 mg/L），L158和I171位點的突變也導(dǎo)致產(chǎn)量顯著降低（均低于10 mg/L）。這種將結(jié)構(gòu)預(yù)測與實驗驗證相結(jié)合的系統(tǒng)方法，清楚地證明了在活性口袋附近戰(zhàn)略性地引入正電荷可以顯著提高磷酸化效率。

為了進一步優(yōu)化PhoN的催化效率，團隊轉(zhuǎn)向了共進化分析策略。通過分析500個與PhoN序列相似度超過80%的酸性磷酸酶序列，利用EMBL-MUSCLE進行多序列比對和ConSurf WEB SERVER進行保守性分析，將氨基酸殘基按保守程度分為九個等級（圖3E）。在距離活性口袋12?范圍內(nèi)，團隊識別出六個非保守殘基：S90、Y135、K153、T157、R160和I222（圖3E-F）。這些殘基在進化過程中表現(xiàn)出較高的可變性，暗示它們可能是潛在的優(yōu)化靶點。通過將這些非保守殘基替換為更具保守性的氨基酸，團隊設(shè)計了十個PhoN變體。發(fā)酵實驗顯示，S90G、T157K和R160K突變使drimenol產(chǎn)量較野生型提高了約1.2倍。這一結(jié)果表明，在漫長的進化過程中，這個酶家族確實傾向于進化出更穩(wěn)定和更高效的形式。

更為可喜的是，當(dāng)將帶電突變（E122R）與進化分析獲得的有益突變（T157K和R160K）組合時，產(chǎn)生了顯著的協(xié)同效應(yīng)。最優(yōu)的三突變體E122R/T157K/R160K使drimenol產(chǎn)量達(dá)到了398 mg/L，較初始產(chǎn)量提升了27倍。為了解釋這種顯著提升的分子機制，團隊成功解析了PhoN^{E122R/T157K/R160K}的晶體結(jié)構(gòu)（PDB: 8YC1，圖4B-C）。與野生型PhoN相比，三突變體的等電點從6.08升至7.72，表明表面正電荷顯著增加。更重要的是，分子動力學(xué)模擬（圖4D）揭示突變體能夠與配體維持長達(dá)40 ns的穩(wěn)定相互作用，相比于野生型PhoN穩(wěn)定作用時間延長了近20 ns，這可能是其催化效率提升的關(guān)鍵原因。

在取得drimenol生產(chǎn)的重要突破后，研究團隊開始評估其在合成中的應(yīng)用。然而，在初步嘗試drimenol碘代物與芳基碘代物的鎳催化還原偶聯(lián)反應(yīng)時，由于β-H消除反應(yīng)的發(fā)生，主要得到二烯產(chǎn)物。這一結(jié)果促使團隊轉(zhuǎn)向探索albicanol，其碘代物在Weix條件下能夠與不同的芳基鹵代物順利發(fā)生偶聯(lián)?；谶@一設(shè)想，研究團隊將優(yōu)化后的PhoN-IPK系統(tǒng)應(yīng)用于albicanol的生產(chǎn)。通過將SsDMS替換為來自Antrodia cinnamomea的環(huán)化酶AncC，初始產(chǎn)量即達(dá)到281 mg/L。

為了進一步提高albicanol的產(chǎn)量，研究團隊對發(fā)酵條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化。通過調(diào)控IPTG濃度（0.05 mM）、甘油濃度（2%），以及優(yōu)化ISO的添加策略，在搖瓶水平將albicanol產(chǎn)量提升至1805 mg/L。更為重要的是，在5L發(fā)酵罐中采用兩階段補料策略，即在OD₆₀₀達(dá)到30時開始補料，當(dāng)albicanol達(dá)到1.6 g/L時追加8 g ISO，最終使產(chǎn)量提升至3.5 g/L（圖4E），創(chuàng)造了微生物發(fā)酵生產(chǎn)albicanol的最高水平。

有了充足的drimane手性砌塊供應(yīng)后，研究團隊開始探索其在雜萜類天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用。團隊通過鎳催化的還原偶聯(lián)反應(yīng)（圖5A），建立了一系列雜萜類化合物的簡潔合成路線（圖5B）。這包括zonarol (1)的3步合成（總收率66%），ent-(+)-chromazonarol (2)的4步合成（總收率65%），mycoleptodiscin A (3)的6步合成（總收率22%），以及pelorol (4)的6步合成（總收率14%）。

中國藥科大學(xué)董廖斌課題組聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)李付琸課題組針對雜萜類天然產(chǎn)物簡潔高效合成問題，創(chuàng)新性地將微生物工程與化學(xué)合成相結(jié)合，建立了一套完整的交叉學(xué)科技術(shù)體系。研究團隊通過系統(tǒng)的酶工程改造和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，成功突破了手性砌塊規(guī)模化制備的瓶頸，并在分子水平闡明了“人工兩步法”體系中酸性磷酸酶的催化機制。這一發(fā)現(xiàn)不僅為后續(xù)開發(fā)更高效的drimane型手性砌塊生物合成體系提供了理論基礎(chǔ)，也為解決其他萜類化合物的生產(chǎn)難題提供了新思路。更重要的是，該研究為天然產(chǎn)物全合成領(lǐng)域提供新穎的研究范式：通過微生物工程獲取關(guān)鍵手性砌塊，繼而通過靈活的化學(xué)轉(zhuǎn)化實現(xiàn)目標(biāo)分子的高效簡潔合成。這種策略避免了傳統(tǒng)全生物合成中需要組裝復(fù)雜酶促級聯(lián)反應(yīng)的困難，同時也克服了有機全合成中手性源獲取困難和步驟冗長的問題，將顯著加速雜萜類生物活性分子的發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)進程。