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氘在過去二十年中成為了藥物化學(xué)研究的主角。近年來，隨著氘代藥物的興起，人們對其在減少潛在毒性、提高代謝穩(wěn)定性和改善藥代動(dòng)力學(xué)特性方面的作用產(chǎn)生了極大興趣。目前，藥物通常通過細(xì)胞色素P450（CYP450）酶介導(dǎo)的氧化代謝，藥物代謝位點(diǎn)上的C-H鍵被更穩(wěn)定的C-D鍵替代，特別是在α-位置與雜原子相鄰時(shí)，C-D鍵作為生物等效物具有增強(qiáng)藥物藥代動(dòng)力學(xué)特性的潛力。這些研究促成了首例氘代藥物——氘代丁苯那嗪（deutetrabenazine）的成功研發(fā)。近年來，基于氘標(biāo)記策略，已開發(fā)出幾種新型氘標(biāo)記藥物，如氘克拉維替尼（deucravacitinib）、氘那非替尼（donafenib）、VV116和氘魯索替尼（deuruxolitinib），這些藥物在各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用中展現(xiàn)了廣泛前景。此外，氘標(biāo)記在其他科學(xué)應(yīng)用中也表現(xiàn)出極大的潛力，如代謝物研究、核磁共振（NMR）光譜學(xué)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用，以及在合成有機(jī)化學(xué)中作為探針揭示反應(yīng)機(jī)制等。因此，探索氘代分子的化學(xué)空間，為多學(xué)科領(lǐng)域內(nèi)功能分子的創(chuàng)新與發(fā)現(xiàn)提供了有前景的路徑（見圖1a）

圖1. 研究背景及意義（來源：Nat. Commun）

氨基酸是生命的基本單元，廣泛存在于小分子藥物、肽類的治療藥物中。氘代氨基酸及其衍生物在闡明生物合成途徑、酶機(jī)制、肽/蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、改善吸收分布代謝排泄（ADME）特性以及增強(qiáng)藥效方面顯示出廣泛的應(yīng)用。此外，氘代的氨基酸藥物候選分子，尤其是在α-位置相對于氮的氘化，已被廣泛研究（見圖1b）。但是，現(xiàn)有的合成方法通常存在一些局限性，包括需要預(yù)先合成的復(fù)雜底物、苛刻的反應(yīng)條件、使用貴金屬和/或毒性催化劑，以及氘代率低等。這些不足以滿足市場對高同位素純度（理想情況下超過98%）氘標(biāo)記活性藥物成分（API）的需求。此外，多個(gè)氘原子的引入可能會(huì)導(dǎo)致化合物的物理性質(zhì)（如溶解度和親脂性）發(fā)生意想不到的變化，進(jìn)而可能影響血漿蛋白結(jié)合（如d?-咖啡因），以及吸收程度和/或速率的差異，同時(shí)也會(huì)增加整體成本。因此，在氘代氨基酸藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域，特別是在氘標(biāo)記α-位置相對于雜原子的位點(diǎn)選擇性引入，保持最小氘原子數(shù)并達(dá)到較高的氘代率，對于提高藥代動(dòng)力學(xué)特性至關(guān)重要。然而，這仍然是一個(gè)無法逾越的挑戰(zhàn)。受到生物還原胺化概念的啟發(fā)，該研究開發(fā)了一種仿生Ca(II)-HFIP催化的還原氘代胺化策略，以高產(chǎn)率和在α-位點(diǎn)選擇性構(gòu)建了一系列氘代氨基酸，肽（見圖1c）。本研究的亮點(diǎn)如下：（1）在方法學(xué)方面，開發(fā)了仿生Ca(II)-HFIP介導(dǎo)的模塊化且高效的還原氘胺化策略，結(jié)合了三種易得的原料——氨基、酮酸酯和d?-HE，可以在溫和反應(yīng)條件（室溫）下進(jìn)行一鍋法合成N-α-氘代氨基酸；（2）在適用范圍方面，多種氨基酸、肽、藥物分子及其各種取代衍生物均具有良好的兼容性；（3）在催化劑回收方面，該催化劑具有較高的水溶性，便于回收；（4）在應(yīng)用方面，該方法能夠應(yīng)用于On-DNA合成實(shí)現(xiàn)DNA編碼的氘代多肽庫的構(gòu)建（見圖1d）。

該團(tuán)隊(duì)首先反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳的反應(yīng)條件：以5 mol%的Ca(NTf₂)₂作為催化劑，d₂-HE₁（1.5 eq）作為氘源，HFIP作為溶劑，在室溫下反應(yīng)12小時(shí)（圖2）。值得注意的是，添加HFIP作為混合溶劑可顯著提高鈣催化的反應(yīng)活性。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了該體系的底物兼容性（圖3）。甲基、異丙基和叔丁基等基團(tuán)得到了良好的耐受，并在優(yōu)異的產(chǎn)率下提供了目標(biāo)氘標(biāo)記氨基酸（2-4）。鹵素取代的苯胺類化合物也與體系兼容，能夠提供相應(yīng)的產(chǎn)物（5-8），產(chǎn)率為78%到98%，為進(jìn)一步通過金屬催化交叉偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行衍生化提供了機(jī)會(huì)。此外，該反應(yīng)還適用于一系列電子結(jié)構(gòu)各異的底物。給電子基團(tuán)表現(xiàn)良好，能夠得到目標(biāo)產(chǎn)物9和10。吸電子基團(tuán)，如-CO₂Me、-SF₅、-OCF₃、-CONH₂、-CONHMe、-CONMe₂、-CN、-NO₂等取代的苯胺，都可以作為可行底物，獲得相應(yīng)產(chǎn)物（11-18）。值得注意的是，在苯胺上引入可還原的官能團(tuán)（如氰基、硝基、酰胺或酯基）時(shí)，反應(yīng)表現(xiàn)出較高的化學(xué)選擇性。氘代氨基酸16的結(jié)構(gòu)通過X射線晶體學(xué)進(jìn)一步得到確認(rèn)。苯環(huán)上取代基的位置對反應(yīng)結(jié)果沒有顯著影響（見產(chǎn)物19和20）。此外，酮酸類化合物作為多功能底物，也能高效地產(chǎn)生相應(yīng)的化合物（21-24），這些化合物在C端具有自由的羧基。進(jìn)一步研究表明，二取代和三取代的苯胺也可以作為適宜的底物，順利生成相應(yīng)的產(chǎn)物（25-29）。該策略不僅限于苯胺，2-萘胺也可以作為底物參與反應(yīng)，得到相應(yīng)的產(chǎn)物（30和31）。硫、氧和氮雜環(huán)化合物在此轉(zhuǎn)化過程中均能保持完整（32-34）。并且，初級烷基胺在反應(yīng)條件下也能得到良好耐受，并能以優(yōu)異的產(chǎn)率得到目標(biāo)產(chǎn)物（35、36）。令人欣慰的是，發(fā)現(xiàn)二級芳基胺與開發(fā)的鈣（II）催化體系具有良好的兼容性。對稱（37-41）和不對稱的二芳基胺（42-45）、芳基-烷基胺（46、47）以及環(huán)狀胺（48-50）均能很好地耐受，得到了相應(yīng)的d₁-甘氨酸。重要的是，該策略能兼容二級烷基胺，產(chǎn)率良好（51、52）。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步考察酮酸酯或酮酸，以合成多種天然/非天然的氘標(biāo)記氨基酸衍生物。使用甲基丙酮酸作為原料，與不同的胺反應(yīng)，順利得到了多種氘標(biāo)記的丙氨酸衍生物（d₁-Ala）（53-64）。多種烷基取代的酮酸酯/酸適用于氘代天然氨基酸衍生物的合成。如d₁-苯丙氨酸（65）、d₁-纈氨酸（66）、d₁-酪氨酸（67）、d₁-色氨酸（68）等。非天然氨基酸因能夠設(shè)計(jì)具有增強(qiáng)穩(wěn)定性和功能性的蛋白質(zhì)，在藥物發(fā)現(xiàn)中引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，乙基取代的酮酸酯、環(huán)狀酮酸酯以及較長碳鏈的酮酸酯可以作為可行的底物，成功合成了相應(yīng)的氘標(biāo)記非天然氨基酸衍生物（d₁-UAAs 69-73），產(chǎn)率為74%到89%。

圖2. 條件優(yōu)化（來源：Nat. Commun）

圖3. 氘代氨基酸及其衍生物的合成（來源：Nat. Commun）

該方法也適用于氘代多肽的合成（圖4）。首先，該研究團(tuán)隊(duì)成功合成了一系列氘代的二肽衍生物（d₁-Gly-Phe）（74-84）。83的結(jié)構(gòu)通過X射線晶體學(xué)得到了確認(rèn)。并且，該策略能夠完美保持原有骨架的手性。不同種類的氘代的二肽85-92成功合成，包含了如丙氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等具有非極性側(cè)鏈的氨基酸，具有極性側(cè)鏈的絲氨酸，及具有堿性側(cè)鏈的賴氨酸等。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探討了增加鏈長對氘代肽類合成的影響，含有丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸和亮氨酸的氘標(biāo)記三肽（95-98）可以在高產(chǎn)率下合成。并且，氨基酸如絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸、脯氨酸、蛋氨酸和賴氨酸的親核殘基能夠與靶向共價(jià)抑制劑（TCIs）中存在的邁克爾受體型電親性靶點(diǎn)形成共價(jià)鍵，因此，這一合成潛力對于靶向共價(jià)藥物的發(fā)現(xiàn)具有重要價(jià)值。

圖4. 氘代多肽的合成（來源：Nat. Commun）

復(fù)雜分子的后期功能化具有巨大的潛力，可以快速構(gòu)建一系列新的藥物骨架。氨氯地平（Amlodipine）是一種鈣通道阻滯劑，廣泛用于臨床治療高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病。該團(tuán)隊(duì)以其為底物，成功合成了相應(yīng)的d₁-氨氯地平-甘氨酸結(jié)合物（d1-Amlodipine-Gly）99（圖5）。隨后，底物普適性研究發(fā)現(xiàn)，磺胺甲噁唑（100）、苯佐卡因（101）、奧司他韋（102）、達(dá)普酮（103）、克唑替尼（104）、吲哚美辛（105）、氟比洛芬（106）、門布酮（107）、苯溴酸（108）、伊索替尼（109）、布洛芬（110）、吉非貝齊（111）、非布司他（112）等藥物分子都能兼容，得到相應(yīng)的氘代氨基酸-藥物結(jié)合物。此外，天然產(chǎn)物如單甲基琥珀酸（113）、月桂酸（114）和吡啶丁酸（115）也能在該反應(yīng)條件下順利反應(yīng)，得到相應(yīng)的產(chǎn)物，并具有良好的產(chǎn)率。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二肽與藥物骨架的連接反應(yīng)也能高效進(jìn)行，成功得到產(chǎn)物d₁-Menbutone-Gly-Phe（116）和d₁-Menbutone-Ala-Val（117）。值得注意的是，這些結(jié)果驗(yàn)證了酰胺、鹵素、磺?；Ⅴ?、酮以及雜環(huán)等官能團(tuán)在該反應(yīng)體系下都能保持穩(wěn)定，未受到影響。毫無疑問，Ca(II)-HFIP介導(dǎo)的復(fù)雜分子后期修飾提供了一種高效且富有吸引力的策略，用于新化學(xué)實(shí)體的合成和潛在的藥物發(fā)現(xiàn)研究。

圖5. 復(fù)雜分子后期修飾（來源：Nat. Commun）

為了進(jìn)一步研究氘標(biāo)記引入化學(xué)實(shí)體是否能提高代謝穩(wěn)定性，該團(tuán)隊(duì)初步進(jìn)行了人體微粒體代謝實(shí)驗(yàn)，以評估代謝穩(wěn)定性，選取68作為模型抗氧化化合物。在180分鐘的微粒體孵育后，殘留的68的量高于68-H。通過計(jì)算，68的半衰期也較68-H有所延長（68-H, t_1/2 = 4.46 h；68, t_1/2 = 5.91 h），這表明氘標(biāo)記在氨基酸α位的引入明顯提高了代謝耐受性（見圖6a）。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了當(dāng)前方法在促進(jìn)氘標(biāo)記氨基酸/肽類的位點(diǎn)選擇性合成方面的顯著價(jià)值。該方法的實(shí)用性通過成功的克級合成氘標(biāo)記氨基酸1和d₁-氨基酸結(jié)合物102（分別以90%和76%的產(chǎn)率）得到了進(jìn)一步證明（見圖6b）。并且催化劑能夠回收利用（見圖6c）。

圖6. 代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)及合成應(yīng)用（來源：Nat. Commun）

為了更好地理解反應(yīng)機(jī)理，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了一系列對照實(shí)驗(yàn)（見圖7a）。當(dāng)加入自由基捕捉劑TEMPO時(shí)，反應(yīng)依然順利進(jìn)行，且產(chǎn)率未發(fā)生下降。AIBN是常用的自由基引發(fā)劑，但在標(biāo)準(zhǔn)條件下，使用AIBN并未提高反應(yīng)產(chǎn)率。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)，排除了自由基機(jī)制的可能性。隨后進(jìn)行的氘代實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)使用d₁-HE1或d₂-HFIP時(shí)，未觀察到氘的引入，這表明產(chǎn)物中的氘來自于Hantzsch酯的4-D。因此，推測氘轉(zhuǎn)移反應(yīng)可能遵循一種協(xié)同機(jī)制，類似于相關(guān)的氫轉(zhuǎn)移還原過程。在Hantzsch酯H-和D-Hantzsch酯的競爭反應(yīng)中，觀察到了動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng)（kH/kD=4.8），這清楚地表明C-H鍵的斷裂是決速步。

基于以上結(jié)果，提出了一個(gè)可能的反應(yīng)路徑，涉及Ca(II)-HFIP介導(dǎo)的還原氘代氨化的協(xié)同機(jī)制（見圖7b）。前的工作中，發(fā)現(xiàn)[Ca(NTf₂)(HFIP)₂]⁺，其中兩個(gè)HFIP分子與鈣離子配位，是最活躍的簇。對于具有O和N原子作為錨點(diǎn)的底物，通過Ca–O配位鍵和一個(gè)HFIP配體的N–H氫鍵形成螯合。第二個(gè)HFIP配體通過F–Ca和O–H鍵穩(wěn)定該復(fù)合物。在當(dāng)前情況下，這種配合物會(huì)生成物種A。隨后，d₂-HE1對亞胺進(jìn)行氘化，生成目標(biāo)產(chǎn)物。最后，通過C的質(zhì)子轉(zhuǎn)移再生催化劑，同時(shí)釋放D（通過NMR分析確認(rèn)）作為副產(chǎn)物。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們首先進(jìn)行了酸度研究，采用Child方法。將HFIP（2 eq）與Ca(NTf₂)₂結(jié)合，導(dǎo)致H_β在7.26 ppm處出現(xiàn)最大化學(xué)位移變化（見圖7c）。這些結(jié)果驗(yàn)證了Ca(II)-HFIP介導(dǎo)系統(tǒng)增強(qiáng)酸性的假設(shè)。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)借助DFT理論計(jì)算，使用M06-2X/6-31+G(d,p)（SMD）計(jì)算了甲基（E）-2-（苯基亞胺）乙酸酯、1,4-二氫-2,6-二甲基-3,5-吡啶二甲酸二甲酯和上述復(fù)合物[Ca(NTf₂)(HFIP)₂]⁺（見圖7d）。如上所述的亞胺乙酸酯的激活確實(shí)使得Hantzsch酯的氫化物和HFIP的質(zhì)子能夠同時(shí)轉(zhuǎn)移，并且自由能為16.7 kcal/mol，這一步驟的反應(yīng)釋放了17.2 kcal/mol的能量。

圖7. 機(jī)理研究（來源：Nat. Commun）

1992年，Lerner和Brenner提出了DNA編碼庫（DEL）技術(shù)，這是一項(xiàng)將化學(xué)與生物學(xué)無縫結(jié)合的革命性技術(shù)，在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域具有重要意義。DEL通常通過多輪酶促DNA條形碼和DNA兼容化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建。因此，推動(dòng)DNA兼容反應(yīng)的進(jìn)展是DEL研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一，極具挑戰(zhàn)。該團(tuán)隊(duì)成功將開發(fā)的策略應(yīng)用于DNA兼容的還原氘代胺化反應(yīng)。通過合理設(shè)計(jì)，該團(tuán)隊(duì)成功合成了多種DNA連接的d₁-氨基酸/肽。正如圖8a所示，DNA連接的胺HP-1與不同的羰基化合物反應(yīng)，成功生成了目標(biāo)DNA-d₁-AA連接物（118）、DNA-d₁-UAA連接物（119-121）和DNA-d₁-肽連接物（122）。值得一提的是，氨基苯環(huán)上取代基的位置對反應(yīng)結(jié)果沒有顯著影響，尤其是meta取代的胺具有良好的兼容性，能夠生成所需的DNA連接物123-127，轉(zhuǎn)化率為44-95%。為了進(jìn)一步探討該DNA上還原氘化胺化反應(yīng)的普適性，我們合成了長鏈DNA連接的胺HP-2和HP-3，結(jié)果證明這些胺在與多種羰基化合物反應(yīng)時(shí)，能夠得到所需的DNA連接的d₁-AA/UAA/肽，轉(zhuǎn)化率為中等至良好（128-137）。

如前所述，Ca(II)-HFIP介導(dǎo)的DNA上還原氘代胺化能夠構(gòu)建所需的DNA連接的d₁-氨基酸，且具有附加的錨定–羧基。這一特性將促進(jìn)它們在多樣性導(dǎo)向合成中的應(yīng)用。為了全面評估該方法在化學(xué)分岐合成中的潛在應(yīng)用，該團(tuán)隊(duì)在DEL中調(diào)查了DNA-d₁-復(fù)雜分子連接物的DNA上合成潛力。如圖8b所示，Ca(II)-HFIP介導(dǎo)的DNA連接胺（HP-1）與羰基底物的還原氘化胺化反應(yīng)順利進(jìn)行，得到DNA連接的d₁-氨基酸（118），該產(chǎn)物在進(jìn)一步與各種胺通過經(jīng)典的酰胺化反應(yīng)后，成功得到所需的DNA連接的d₁-復(fù)雜分子（138和139），產(chǎn)率達(dá)到合成上有用的水平。這些結(jié)果證明了所開發(fā)策略的兼容性，并突出了其在DEL構(gòu)建中的巨大潛力。

圖8. DNA偶聯(lián)d1-氨基酸/肽的合成及其多樣化轉(zhuǎn)化（來源：Nat. Commun）

該團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種通過仿生還原氘代胺化反應(yīng)，直接合成氘代氨基酸/肽的方法。該方法利用地球豐度且環(huán)保的鈣基催化劑，在HFIP中以仿生d₂-Hantzsch酯作為氘源，成功地實(shí)現(xiàn)了簡單酮酯與胺類的氘化反應(yīng)。該策略具有溫和的反應(yīng)條件、高產(chǎn)率、良好的底物適應(yīng)性、優(yōu)異的氘代水平以及α-位置至N-雜原子的位點(diǎn)選擇性氘化特點(diǎn)。催化劑的高水溶性使得其能夠被輕松回收，支持多次循環(huán)使用，充分體現(xiàn)了該協(xié)議的高效性和可持續(xù)性。通過其在克級合成和藥物分子及天然產(chǎn)物的后期氘化中的應(yīng)用，已證明了該方法的實(shí)用性和穩(wěn)健性。此外，所開發(fā)的氘標(biāo)記策略在提高代謝穩(wěn)定性方面也展現(xiàn)了其功能性。最后，鈣催化劑已成功應(yīng)用于DNA編碼庫合成，實(shí)現(xiàn)了DNA標(biāo)記的氘代氨基酸/肽/藥物的合成，這一進(jìn)展展示了在合成氘代DNA編碼庫（dDEL）方面的巨大潛力，有望高效探索超大規(guī)模的氘代化學(xué)空間。

王勝東，教授、廣東省“珠江人才計(jì)劃”青年拔尖人才。2018年獲得雷恩第一大學(xué)博士學(xué)位；隨后于巴黎薩克雷大學(xué)從事博士后研究；2021年以南山學(xué)者特聘教授加入廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。研究興趣為綠色藥物合成策略的設(shè)計(jì)與開發(fā)、廉價(jià)金屬催化的有機(jī)方法學(xué)研究；以第一/通訊作者在Angew. Chem. Int. Ed.、Nat. Commun.、ACS Catal.、ChemSusChem、Org. Lett.等著名期刊上發(fā)表論文二十余篇。    

易偉，呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授、廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院副院長（分管科研）；博士生導(dǎo)師、南山學(xué)者杰出人才、廣東省杰青、廣州市嶺南英杰；中科院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)會(huì)員、中國藥學(xué)會(huì)會(huì)員、中國藥理學(xué)會(huì)會(huì)員、中國化學(xué)會(huì)會(huì)員。主要從事以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)、功能為導(dǎo)向的創(chuàng)新藥物設(shè)計(jì)與發(fā)現(xiàn)。迄今在Nature、Cell Res.、Chem、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Sci.、ACS Catal.、Chem. Sci.、PNAS、APSB等國際著名期刊上已發(fā)表研究論文100余篇，總他引率4000余次，h指數(shù)大于40。申請國內(nèi)外發(fā)明專利10余項(xiàng)（包括美國專利一項(xiàng)、PCT五項(xiàng)），其中部分已成功轉(zhuǎn)讓，總金額近800萬美元。

許紅濤，上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所副研究員。研究工作聚焦于藥物化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，在DNA編碼化合物庫（DEL）的構(gòu)建與篩選，生物大分子的選擇性修飾和工程化免疫細(xì)胞等方面積累了豐富的研究經(jīng)驗(yàn)。迄今在Angew. Chem. Int. Ed.、Nat. Commun.、Chem、Adv. Sci.、ACS Catal.、APSB等國際著名期刊上已發(fā)表研究論文100余篇。